LncRNA BRE-AS1在急性心肌梗死患者血清中表達(dá)及對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

李現(xiàn)立，胡豐朝，韓兆帥

急性心肌梗死（AMI）是最嚴(yán)重的心血管疾病之一，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率[1]。缺氧發(fā)生在急性冠狀動脈阻塞中，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，是AMI的第一階段。在原發(fā)性血管成形術(shù)中會發(fā)生完全的再灌注/再充氧，是一個有害事件[2]。缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)局部心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致不可逆的心肌損傷[3]。基因組的非蛋白質(zhì)編碼部分因其在發(fā)育過程中的功能而受到越來越多的關(guān)注[4]。根據(jù)大小，非編碼RNA可分為兩大類：長非編碼RNA（lncRNA，＞200個核苷酸）和短非編碼RNA（＜200個核苷酸，主要包括miRNA）。非編碼RNA在包括AMI在內(nèi)的人類心血管疾病中異常表達(dá)并發(fā)揮著重要作用[5]。Ling等[6]通過lncRNA差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，lncRNA BRE-AS1在AMI患者血清中高表達(dá)，作為AMI早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。然而，lncRNA BRE-AS1在AMI中的作用，特別是lncRNA BRE-AS1對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響和機制尚未闡明。本研究將通過研究lncRNA BRE-AS1在AMI患者血清中的表達(dá)及其對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AC16氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步揭示AMI發(fā)生發(fā)展的分子機制，以期為AMI診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自美國 Gibco 公司；lncRNA BREAS1引物、siRNA、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；mirVANA miRNA isolation kit購自美國Ambion Life Technologies公司；SuperScript-III reverse transcriptase、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；SYBR? Green PCR Master Mix 購自美國Applied Biosystems公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、MTT、GAPDH抗體購自上海碧云天生物技術(shù)公司；p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2購自美國 abcam公司，二抗購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 一般資料收集2017年6月至2019年12月安陽地區(qū)醫(yī)院心內(nèi)二科住院治療的AMI患者108例和健康體檢者102例血清樣本。納入研究的AMI患者基于最新的心肌梗死普查標(biāo)準(zhǔn)，在臨床上通過檢測生化指標(biāo)（心肌肌鈣蛋白I）含量、是否有急性缺血性胸痛以及心電圖改變和冠狀動脈造影來診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者的臨床資料完整，能配合隨訪及治療；②明確診斷為急性心肌梗死；③患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重感染者；②合并血液、免疫系統(tǒng)疾病患者；③獲得初始血樣之前接受靜脈溶栓或抗凝治療；④患者不配合此次研究。本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有參與者均已簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人心肌細(xì)胞AC16購自美國ATCC公司，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取1×106個對數(shù)生長期的AC16細(xì)胞接種于6孔板中，置于95%N2和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用95%O2和5%CO2復(fù)氧20 min。在H/R處理后12 h、24 h和48 h時測定基因表達(dá)，以24 h時測定細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)、增殖和凋亡變化。以常氧條件下細(xì)胞為對照。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期AC16細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，用Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑將陰性對照siRNA和lncRNA BREAS1 siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，分別記為沉默對照組、沉默BRE-AS組，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

1.5 qPCR檢測利用mirVANA miRNA isolation kit試劑盒提取血清中總RNA，SuperScript-III reverse transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBR? Green PCR Master Mix試劑盒于ABI 7500實時定量PCR儀上檢測lncRNA BRE-AS1表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。lncRNA BRE-AS1正向引物：5'-GTT GAT TGT CGG CAT TAC TG-3'，反向引物:5'-CAT CGT TTT CAG AGG TTG TA-3'；GAPDH正向引物：5'-TAT GAT GAT ATC AAG AGG GTA GT-3'，反向引物5'-TGT ATC CAA ACT CAT TGT CAT-3'。

1.6 檢測MDA、SOD和GSH-PX含量根據(jù)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒說明書測定AC16細(xì)胞中MDA、SOD和GSH-PX的含量。

1.7 細(xì)胞增殖檢測取對數(shù)生長期各組細(xì)胞分別接種于96孔板中，密度為4×103個/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，酶標(biāo)儀震蕩10 min以溶解結(jié)晶并檢測490 nm處各孔吸光值。

1.8 細(xì)胞凋亡實驗取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，收集在5 ml試管中，用冷PBS洗滌2次，以1×106細(xì)胞/ml的終濃度重懸于用1×結(jié)合緩沖液中，加入FITC-AnnexinV和PI輕輕混合，并在室溫下與細(xì)胞孵育15 min。孵育后，在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.9 Western blot檢測RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用p-p38、p38、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗稀釋液于4℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗稀釋液室溫孵育2 h，后經(jīng)TBST洗滌后用ECL發(fā)光液孵育條帶并置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光顯影，Image J軟件分析各個蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以（）表示，兩組數(shù)據(jù)采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性心肌梗死患者血清中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)qPCR檢測108例AMI患者和102例健康志愿者血清中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)，結(jié)果顯示，AMI患者血清中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)（2.95±1.92）高于健康志愿者（1.06±0.83），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.347，P＜0.05）；缺氧復(fù)氧12 h、24 h和48 h后人心肌細(xì)胞AC16中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)（1.46±0.14、1.95±0.17、2.03±0.21）高于常氧組AC16細(xì)胞（0.98±0.09），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.995、8.734、7.960，P＜0.05）。

2.2 沉默AC16細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)qPCR檢測結(jié)果顯示，沉默BRE-AS1組AC16細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BRE-AS1表達(dá)水平（0.12±0.01）低于沉默對照組（1.02±0.10），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.511，P=0.004）。

2.3 沉默lncRNA BRE-AS1對H/R處理后AC16氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響結(jié)果如表1所示，與常氧組比較，H/R組AC16細(xì)胞中MDA含量顯著增加，SOD和GSH-PX含量顯著降低；與H/R+沉默對照組比較，H/R+沉默BRE-AS1組AC16細(xì)胞中MDA含量顯著降低，SOD和GSH-PX含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明沉默lncRNA BRE-AS1可顯著抑制H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.4 沉默lncRNA BRE-AS1對H/R處理后AC16細(xì)胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果如表2所示，與常氧組比較，48 h、72 h時H/R組AC16細(xì)胞相對吸光度值顯著降低；與H/R+沉默對照組比較，48 h、72 h時H/R+沉默BRE-AS1組AC16細(xì)胞相對吸光度值顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明沉默lncRNA BRE-AS1可逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞增殖抑制。

表1 沉默lncRNA BRE-AS1后H/R誘導(dǎo)AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（）

表1 沉默lncRNA BRE-AS1后H/R誘導(dǎo)AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（）

注：與常氧組比較，aP＜0.05；與H/R+沉默對照組比較，bP＜0.05

2.5 沉默lncRNA BRE-AS1對H/R處理后AC16細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖1所示，與常氧組（3.89±0.51）%比較，H/R組AC16細(xì)胞凋亡率（17.57±1.52）%明顯增加（t=14.779，P=0.002）；與H/R+沉默對照組（18.02±1.61）%比較，H/R+沉默對照組AC16細(xì)胞凋亡率（8.41±0.82）%顯著降低（t=9.213，P=0.003），表明沉默lncRNA BRE-AS1可顯著抑制H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞凋亡。

2.6 沉默lncRNA BRE-AS1對H/R處理后AC16細(xì)胞中p38/MAPK信號通路的影響H/R組AC16細(xì)胞中p-p38、p-ERK1/2表達(dá)（0.87±0.09、0.79±0.08）較常氧組（0.28±0.03、0.25±0.03）比較顯著增加（t=10.772、10.947，P＜0.01）；沉默BRE-AS1組AC16細(xì)胞中p-p38、p-ERK1/2表達(dá)（0.37±0.04、0.35±0.04）較常氧組（0.94±0.09、0.82±0.08）比較顯著增加（t=10.024、9.102，P＜0.01）（圖2）。

3 討論

AMI仍然是最常見的致死性疾病之一，其主要特征是心臟部分血液供應(yīng)中斷，從而損害心肌[7,8]。缺血和再灌注（I/R）損傷是AMI的常見原因，其可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和死亡[9,10]，預(yù)防心肌I/R損傷的幾種治療策略能改善AMI患者預(yù)后[11]。由于尚不清楚心肌I/R損傷的潛在機制，目前心血管疾病仍然是全球住院和死亡的主要原因。因此，闡明預(yù)防心肌I/R損傷的關(guān)鍵機制對于開發(fā)治療AMI的有效治療方法具有重要意義。

表2 沉默lncRNA BRE-AS1后H/R誘導(dǎo)AC16細(xì)胞增殖變化（）

表2 沉默lncRNA BRE-AS1后H/R誘導(dǎo)AC16細(xì)胞增殖變化（）

注：與常氧組比較，aP＜0.05；與H/R+沉默對照組比較，bP＜0.05

圖1 沉默lncRNA BRE-AS1對H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western blot檢測沉默lncRNA BRE-AS1對H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞中p38/MAPK信號通路蛋白表達(dá)的影響

長非編碼RNA（lncRNA）是內(nèi)源性細(xì)胞RNA，是mRNA樣的轉(zhuǎn)錄物，長度從200 nt～100 kb不等[12,13]。由于缺乏明顯的開放閱讀框，lncRNAs不能作為蛋白質(zhì)合成的模板，但已鑒定出幾種lncRNAs在許多心血管疾病中起著重要作用[14,15]。例如，lncRNA自噬促進(jìn)因子（APF）可以調(diào)節(jié)心肌梗塞，并可能成為心肌梗塞的潛在靶標(biāo)[16]。LncRNAs鋅指反義1（ZFAS1）和Cdr1反義（CDR1AS）在AMI患者中異常表達(dá)，可能是AMI的新生物標(biāo)志物[17]。據(jù)報道，心肌梗死患者血清中l(wèi)ncRNA BRE-AS1水平顯著高于健康志愿者[6]，然而，lncRNABRE-AS1的異常表達(dá)在AMI后的心肌缺血/再灌注損傷中的作用和機制仍不清楚。本研究結(jié)果表明，AMI患者血清和H/R誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BRE-AS1高表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA是包括冠心病和動脈粥樣硬化等在內(nèi)的心血管疾病的遺傳危險因素之一[1]，提示lncRNA BRE-AS1可能是AMI的潛在遺傳標(biāo)志物。此外，沉默lncRNA BRE-AS1逆轉(zhuǎn)了H/R對AC16增殖的抑制和氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，提示lncRNA BRE-AS1在H/R誘導(dǎo)的心肌損傷中起促進(jìn)作用。

多項研究表明，在I/R過程中p38通常被激活，而抑制p38可顯著降低I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[18,19]。為了進(jìn)一步闡明lncRNA BRE-AS1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機制，測定了p38/MAPK信號通路蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中p38/MAPK信號通路蛋白p-p38和p-ERK1/2表達(dá)，沉默lncRNA BRE-AS1可抑制H/R誘導(dǎo)的p38/MAPK信號通路激活，這些發(fā)現(xiàn)與在I/R誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞、腦細(xì)胞和慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞損傷中的結(jié)果相似[20-22]，提示lncRNA BRE-AS1可能通過p38/MAPK信號通路促進(jìn)了H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA BRE-AS1在AMI患者血清中高表達(dá)，沉默其表達(dá)能夠抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，其機制可能與抑制p38/MAPK信號通路有關(guān)，提示lncRNA BRE-AS1可能作為AMI患者的新型潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物。雖然本研究結(jié)果可能有助于尋找AMI過程中的新型分子途徑，但還應(yīng)考慮更進(jìn)行深入的臨床研究、進(jìn)一步的體內(nèi)實驗以及在原代心肌細(xì)胞中進(jìn)行功能分析，進(jìn)一步對lncRNA BRE-AS1在AMI中的作用機理進(jìn)行研究，進(jìn)一步的研究調(diào)查將可為預(yù)防心肌細(xì)胞缺氧引起的損傷或凋亡提供新的分子靶標(biāo)。