大蔥雄性不育的研究和應(yīng)用進(jìn)展

康香輝，安進(jìn)軍，袁瑞江，王麗喬

（河北石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，050021）

大 蔥 （Allium fistulosumL.var.gigantumMakino）屬于蔥科蔥屬作物，起源于中國(guó)西部和西伯利亞地區(qū)，經(jīng)野生蔥馴化而來(lái)。目前主要栽培于中國(guó)、韓國(guó)、日本、馬來(lái)西亞、菲律賓和印度尼西亞。大蔥在我國(guó)有2 600多a的栽培歷史，作為一種綠色保健蔬菜以及調(diào)味品而深受人們的喜愛(ài)[1]。大蔥自交衰退嚴(yán)重，且雜交優(yōu)勢(shì)明顯，但其雜交育種研究起步較晚，直到20世紀(jì)70年代日本西村米八在自然群體中發(fā)現(xiàn)了雄性不育株，大蔥雜交育種才得以開(kāi)展，并進(jìn)行深入研究[2～7]。

雄性不育（male sterility）是指雄性器官發(fā)育不良，失去生殖功能，導(dǎo)致不育的特性，在植物界普遍存在，據(jù)統(tǒng)計(jì)已在43個(gè)科162個(gè)屬617個(gè)物種及種間雜種中發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。雄性不育系的發(fā)現(xiàn)避免了人工去雄的復(fù)雜過(guò)程，是雜交制種的一種高效途徑[8]，已作為重要手段用于各種作物的雜交育種中，尤其是自花授粉作物和常異花授粉作物雜交[9]。

1 大蔥雄性不育的類(lèi)型

由于植物雄性不育性遺傳關(guān)系復(fù)雜，人們提出了很多假說(shuō)對(duì)其進(jìn)行解釋。Edwardson的 “二型假說(shuō)”將雄性不育分為2種類(lèi)型：一是細(xì)胞核雄性不育（genic male sterility，GMS），由核基因控制并遵循孟德?tīng)栠z傳定律；二是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)互作的雄性不育，也稱(chēng)細(xì)胞質(zhì)雄性不育 （cytoplasmic male sterility，CMS）[10]。日本馬上武彥提出大蔥雄性不育是由胞質(zhì)與兩對(duì)隱性核基因互作控制的遺傳模式[11]。張啟沛等[4]發(fā)現(xiàn)該遺傳模式不能完全解釋育種中出現(xiàn)的保持系自交育性分離問(wèn)題，于是提出了“胞質(zhì)—多對(duì)核基因的數(shù)量效應(yīng)”的假說(shuō)?？梢钥隙ǖ氖?，大蔥的雄性不育是受胞質(zhì)與核基因互作控制的。

2 大蔥雄性不育的形態(tài)細(xì)胞學(xué)研究

2.1 大蔥雄性不育的形態(tài)研究

大蔥雄性不育株雄蕊的花絲較短，花藥較小。1987年，張啟沛等[4]對(duì)大蔥不育株的器官進(jìn)一步觀察比較，認(rèn)為可分為3種類(lèi)型：常藥型不育、瘦藥型不育和短雄蕊型不育。大蔥的雄性不育株有完全不育株和半不育株（嵌合性雄性不育），半不育株的出現(xiàn)主要受遺傳、溫度和種株?duì)I養(yǎng)狀態(tài)的影響[12]。2014年，吳蘭榮等[13]對(duì)不同敗育程度的雄性不育系及正常可育材料20余份進(jìn)行育性鑒定，發(fā)現(xiàn)12份雄性不育材料中有9份具有光溫敏感性，說(shuō)明大蔥雄性不育材料具有光溫敏感性的材料居多，但作用機(jī)理尚不明確。

2.2 大蔥雄性不育的細(xì)胞學(xué)研究

日本西村米八在發(fā)現(xiàn)蔥的雄性不育株后，對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞組織學(xué)研究，認(rèn)為小孢子在發(fā)育過(guò)程中受絨氈層增大細(xì)胞擠壓而敗育[10]。1991年，席湘媛[14]通過(guò)觀察大蔥不育系和可育系的花藥和花粉的發(fā)育情況，認(rèn)為大蔥不育系花粉敗育發(fā)生在單核小孢子期的早期。1992年，欒兆水等[7]用壓片法對(duì)雄性不育大蔥小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育進(jìn)行了詳細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)大蔥雄性不育的小孢子發(fā)生過(guò)程基本正常，花粉敗育始于小孢子單核中期和末期，期間有94.85%的花粉敗育。2007年，王曉靜等[15]利用石蠟切片法對(duì)大蔥雄性不育系及保持系花藥與花粉發(fā)育過(guò)程進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)雄性不育系的花粉敗育發(fā)生于單核小孢子晚期，具有單核敗育的特征，花粉敗育不僅與絨氈層有關(guān)，還與中層細(xì)胞密切相關(guān)。馮大領(lǐng)等[16]通過(guò)對(duì)大蔥不育系和保持系花藥發(fā)育的研究，發(fā)現(xiàn)大蔥不育系的花粉敗育是絨氈層細(xì)胞的提早液泡化并解體或者是絨氈層細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)濃度低，無(wú)明顯的多核現(xiàn)象而引起花粉粒敗育；另外在單核花粉粒至成熟花粉粒發(fā)育過(guò)程中，有些花藥的藥隔細(xì)胞纖維化，阻礙了水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，從而引起花粉粒敗育。而保持系的花藥絨氈層細(xì)胞在單核花粉粒時(shí)期開(kāi)始解體，一直到花粉粒成熟才逐漸消失。

3 大蔥雄性不育的分子遺傳學(xué)研究

大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子研究相對(duì)較少，蓋樹(shù)鵬等[17～20]用220個(gè)RAPD隨機(jī)引物分析了大蔥不育系和保持系的葉綠體DNA（cpDNA）和線粒體DNA（mtDNA），其中有5個(gè)引物在葉綠體或線粒體基因組中擴(kuò)增出了多態(tài)性片段，可用于分子標(biāo)記輔助育種，隨后又把不穩(wěn)定、誤差比較大的RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記。2005年，日本學(xué)者利用AFLP、CAPS及SSR標(biāo)記構(gòu)建了第一張大蔥的遺傳圖譜[21]。2013年，Wang等[22]用256個(gè)AFLP分子標(biāo)記對(duì)9個(gè)大蔥雄性不育細(xì)胞質(zhì)與正常細(xì)胞質(zhì)的mtDNA進(jìn)行分子標(biāo)記，篩選出了1條清晰的多態(tài)性AFLP帶，可作為區(qū)分不育系和可育系的AFLP標(biāo)記。AFLP標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化為一個(gè)序列特征的擴(kuò)增區(qū)（SCAR）標(biāo)記SCAR1，可用于區(qū)分雄性不育系和正常細(xì)胞質(zhì)。2015年，Gao等[23]也篩選出了2個(gè)SCAR標(biāo)記，用于區(qū)分大蔥雄性不育株和可育株。2016年，張丹丹[24]以鞭桿蔥不育系和保持系為材料，克隆了大蔥線粒體基因atp6、atpA、nad9、nad5、orf192、orf111、orf100、mat-R全長(zhǎng)； 通過(guò)序列對(duì)比，找出了鞭桿蔥雄性線粒體基因不育系與保持系之間的差異；同時(shí)對(duì)這些基因進(jìn)行了差異性表達(dá)分析。2019年，Liu等[25]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了不育系64-2與相應(yīng)的保持系64-1之間的差異，以確定與雄性不育相關(guān)的基因和途徑，試驗(yàn)表明，大蔥雄性不育調(diào)控基因和途徑可能與線粒體和細(xì)胞核有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，他們又對(duì)ATPase同工酶和atp酶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)ATP合成酶α亞基在雄性不育中特異表達(dá)，而且在不育系及其保持系中，atpA編碼序列的全長(zhǎng)是相同的，但在翻譯的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致氨基酸替換的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），所以推測(cè)atpA基因參與了雄性不育的發(fā)育[26]。關(guān)于大蔥花粉育性恢復(fù)基因染色體定位也有報(bào)道[27，28]。目前關(guān)于大蔥雄性不育分子機(jī)制的研究報(bào)道較少，分子敗育機(jī)制還不清楚。

4 大蔥雄性不育的創(chuàng)制及應(yīng)用

4.1 大蔥雄性不育系的創(chuàng)制

開(kāi)展大蔥育種的國(guó)家主要是日本，始于20世紀(jì)80年代，大蔥雄性不育系及雜種一代的選育則與中國(guó)同步。日本大蔥一代雜種的普及率達(dá)90%[29]。20世紀(jì)80年代以前，中國(guó)以引種和混合選育的常規(guī)育種方式為主；80年代后開(kāi)始雜交育種和雄性不育系的創(chuàng)制及應(yīng)用。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所和石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院等單位，利用自然群體中的雄性不育株，經(jīng)過(guò)多代回交先后創(chuàng)制出大蔥雄性不育系和保持系。2002年，佟成富等[30]創(chuàng)制了大蔥不育系244A。2006年，陳立東等[31]創(chuàng)制了超早熟大蔥雄性不育系603A、626A。2008年，袁瑞江等[32]在青葉1號(hào)大蔥中選育出了雄性不育系08青601A；2019年，又創(chuàng)制了大蔥雄性不育系353A[33]。

4.2 大蔥雄性不育的育種

我國(guó)栽培大蔥歷史悠久，通過(guò)混合選擇和母系選擇育出了很多優(yōu)良的地方品種和農(nóng)家品種。然而大蔥自交衰退嚴(yán)重，且綜合性狀優(yōu)良的品種少，但其雜交優(yōu)勢(shì)明顯。大蔥雄性不育株發(fā)現(xiàn)后，許多科研人員發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制了優(yōu)良雄性不育系，并利用雄性不育系雜交選育出很多優(yōu)良品種。1999年，Kenichiro等[34，35]通過(guò)多代回交培育出了具有野生種（A.galanthumKar.et Kir.）細(xì)胞質(zhì)的大蔥雄性不育系，其可作為大蔥商業(yè)化F1代雜交種制種的親本。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和山東章丘區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局以章丘大蔥中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株為不育源，育成雄性不育系和相應(yīng)的保持系，不育株率達(dá)95%，并利用雄性不育系配制了一些雜交組合，比對(duì)照增產(chǎn)15%以上[4]。2002年，遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院以冬靈白大蔥中發(fā)現(xiàn)的不育株為不育源，育成了不育株率和不育度均達(dá)100%的大蔥雄性不育系，并配制了雜交種遼蔥二號(hào)，產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯[30]。魏星等[36]以日本大蔥中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株為不育源，篩選出耐抽薹雄性不育系和相應(yīng)的保持系，不育株率99%以上，且雜交選配的農(nóng)大夏蔥1號(hào)抽薹晚、抗性好、產(chǎn)量高。袁瑞江等[32]利用三系雜交技術(shù)培育出的青雜2號(hào)可一年四季栽培，是青蔥栽培的理想品種。隨后，袁瑞江等[33]又以常規(guī)種青葉1號(hào)中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株為不育源，育成了不育株率和不育度均接近100%的大蔥雄性不育系，育成的雜交組合抗逆性和產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯。李娜等[37]以章丘大梧桐中發(fā)現(xiàn)的不育株為不育源，育成了新型不育系63A和相應(yīng)的保持系63B，以63A為母本與不同類(lèi)型的自交系配制多個(gè)雜交組合，其雜交組合性狀穩(wěn)定，抗倒性強(qiáng)，是比較理想的春播品種。

5 大蔥雄性不育研究展望

大蔥育種研究較其他蔬菜起步晚，種質(zhì)資源搜集保存的較少，遺傳背景相對(duì)狹窄。大蔥雄性不育的研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱，不育系的開(kāi)發(fā)研究和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的配組有待進(jìn)一步提高。為了更好地將雄性不育系應(yīng)用在大蔥雜交育種上，需要在以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究。

5.1 雄性不育資源創(chuàng)制

科研人員應(yīng)對(duì)大蔥地方品種、農(nóng)家品種或現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行觀察與篩選，以尋找天然不育材料；并嘗試通過(guò)對(duì)種子誘變 （化學(xué)誘變或射線誘變）和基因工程等技術(shù)創(chuàng)制具有不同遺傳基因的大蔥不育源；同時(shí)重視利用遠(yuǎn)緣雜交等常規(guī)育種方式獲得具有優(yōu)良性狀的不育系，從而獲取理想的大蔥雄性不育資源。

5.2 強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合選配

加強(qiáng)對(duì)雄性不育系遺傳機(jī)制的研究，從品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等農(nóng)藝性狀綜合考慮，選擇優(yōu)良的保持系，對(duì)其不育系進(jìn)行回交，改變不利性狀，選出綜合性狀優(yōu)良的不育系與表現(xiàn)良好的父本配組，并在親本一般配合力高的基礎(chǔ)上選擇特殊配合力高的組合，以期獲得更好的雜交組合。

5.3 加強(qiáng)雄性不育基礎(chǔ)理論研究

隨著植物基因組學(xué)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，借助高通量測(cè)序平臺(tái)，人們已經(jīng)對(duì)大蔥雄性不育分子篩選和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行了研究[19，26]，但細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體基因和核基因的互作模式、雄性不育基因的鑒定和功能分析等基礎(chǔ)研究和不育標(biāo)記的開(kāi)發(fā)等工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。另外，不育性的環(huán)境穩(wěn)定性問(wèn)題，也是限制不育性應(yīng)用的一大障礙，應(yīng)對(duì)雄性不育溫敏特性進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，尤其是溫度調(diào)節(jié)育性開(kāi)關(guān)機(jī)理的研究，以加快大蔥雄性不育機(jī)理研究進(jìn)展。