人參皂苷Rg1調(diào)控TLR4/NF?κB信號通路抗重癥肺炎大鼠心肌組織損傷的機制探討

孫治霞，索紅亮，李華，李宗尚，施光遠

重癥肺炎是一種發(fā)病率和致死率很高的呼吸系統(tǒng)感染病癥，可引起組織器官嚴重缺血、缺氧，造成多器官功能損傷［1］；其中，心肌損傷是常見的肺外并發(fā)癥之一，其持續(xù)性發(fā)展可導(dǎo)致患者心功能障礙和心力衰竭［2］。因此，如何降低重癥肺炎對心肌細胞的損傷備受關(guān)注。人參皂苷Rg1是從中藥人參中提取的一種三醇型皂苷，具有抗炎、抗疲勞和抗腫瘤等廣泛的藥理活性［3］。在心肌缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病等疾病中人參皂苷Rg1可通過減輕心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)對心肌損傷表現(xiàn)出較好的保護作用［4?5］，但關(guān)于人參皂苷Rg1對重癥肺炎心肌損傷的作用研究鮮有報道。肺炎克雷伯菌是一種醫(yī)院感染中常見的致病菌，可通過釋放大量脂質(zhì)體成分的菌膜促進內(nèi)源性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成包括心肌組織在內(nèi)的多種器官損傷，氣管注入其菌液是構(gòu)建重癥肺炎大鼠模型常用的建模方式［6?7］。本研究通過觀察人參皂苷Rg1對重癥肺炎大鼠心肌組織的影響，旨在揭示其抗炎和抗心肌細胞凋亡是否在抗重癥肺炎心肌損傷中發(fā)揮作用，以期為重癥肺炎心肌損傷的防治提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料肺炎克雷伯菌株（貨號：ATCC13883，美國ATCC），清潔級體質(zhì)量180～220 g SD大鼠［許可證號：SYXK（京）2017?0022，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司］；人參皂苷Rg1（貨號：HG027162，寶雞市辰光生物科技有限公司），B型鈉尿肽（BNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（CK?MB）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：SEKR?0058、SEKR?0048、SEKR?0059，北京索萊寶），活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase?3）、非活化態(tài)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（procaspase?3）、Bcl?2、Bcl?2相關(guān)X蛋白（Bax）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子?κB（NF?κB）p65和磷酸化（p）?NF?κB p65以及β?actin抗體（貨號：ab214430、ab32150、ab182858、ab182733、ab13556、ab219413、ab237591、ab239882、ab8226，英國Abcam），實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：RR047A，日本Takara Bio）。全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：Tanon 3500，上海天能科技有限公司），動物心功能分析系統(tǒng)（型號：MPA?CFS，上海奧爾科特生物科技有限公司），酶標(biāo)儀（型號：Multiskan FC，美國賽默飛公司），脈搏血氧儀（型號：YX300，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），qPCR儀（型號：TL988，西安天隆科技有限公司）。

1.2 重癥肺炎大鼠模型構(gòu)建和分組處理模型構(gòu)建［8］：采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，頸部剃毛消毒備皮；無菌條件下，切開頸部皮膚使上端器官暴露出來后，以注射器穿刺氣管的方式注入以0.45%無菌鹽水稀釋制備的肺炎克雷伯菌溶液（1.2×109CFU/mL）0.3 mL，之后將大鼠直立保持30～40 s后進行傷口縫合和消毒。模型構(gòu)建成功判斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：術(shù)后大鼠有呼吸急促和行動遲緩現(xiàn)象出現(xiàn)，同時以脈搏血氧儀檢測大鼠后足血氧飽和度小于0.90。將構(gòu)建成功的40只大鼠分為模型組和低、中、高劑量藥物組，每組10只；另取10只未處理大鼠作為對照組。其中，低、中、高劑量藥物組大鼠以2.5、5和10 mg/kg人參皂苷Rg1灌胃，模型組和對照組大鼠以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)14 d。

1.3 蘇木精?伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)并行積分統(tǒng)計麻醉處死大鼠后，取心肌組織；以4%多聚甲醛固定后制備石蠟切片并行常規(guī)的HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化，并參照文獻［10］方法統(tǒng)計大鼠心肌組織病理積分，即以心肌組織中壞死細胞及炎性細胞浸潤面積與視野內(nèi)總面積的百分比表示病變面積；病變面積≥75%記4分，50%～＜75%記3分，25%～＜50%記2分，＜25%記1分，無病變記0分。

1.4 心臟彩超檢測大鼠心功能指標(biāo)藥物干預(yù)結(jié)束后，麻醉并固定大鼠，分離右側(cè)頸總動脈，使用心臟彩超測定大鼠心功能指標(biāo)，包括左室舒張壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室最大舒張速率（?dP/dtmax）和左室最大收縮速率（+dP/dtmax）值。

1.5 ELISA法檢測血清中BNP、cTnI和CK?MB含量大鼠處死后，開胸腔取左心室血液，以4 000 r/min離心10 min收集上清液，參照ELISA試劑盒說明書檢測BNP、cTnI和CK?MB含量。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測心肌組織中白細胞介素（IL）?6、IL?1β和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）mRNA水平采用Trizol法抽提心肌組織總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，根據(jù)上海生工合成的引物在設(shè)定的擴增條件下進行PCR擴增。心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?α水平以2?ΔΔCt法計算，以β?actin為內(nèi)參。擴增條件：95℃4 min；95℃15 s、58℃30 s，35個循環(huán)。IL?6：上游引物5'?ATTG?TATGAACAGCGATGATGCAC?3'，下 游 引 物5'?CCAGG?TAGAAACGGAACTCCAGA?3'，擴增片段長度為528 bp；IL?1β：上游引物5'?CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA?3'，下游引物5'?CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA?3'，擴增片段 長 度 為809 bp；TNF?α：上 游 引 物5'?GCCACCAC?GCTCTTCTGTCT?3'，下游 引 物5'?TCTCCCTCCCCAACTCT CCT?3'，擴增片段長度為701 bp；β?actin：上游引物5'?CCCATCTATGAGGGTTACGC?3'，下游引物5'?TTTAATGT?CACGCACGATTT?3'，擴增片段長度為252 bp。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測心肌組織中cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2、Bax、TLR4、MyD88、NF?κB p65和p?NF?κB p65蛋白表達水平向心肌組織中加入組織裂解液抽提組織總蛋白后，以二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品行電泳分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，β?actin、cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2、Bax、TLR4、MyD88、NF?κB p65和p?NF?κB p65一抗4℃孵育過夜；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后，化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光。以β?actin為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析各組目的蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗中所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以單因素方差分析對多組間數(shù)據(jù)進行比較，以SNK?q檢驗進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)和積分的比較對照組大鼠心肌組織中心肌細胞呈整齊排列，組織結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大鼠心肌組織中心肌細胞排列紊亂且腫脹變形，肌纖維部分斷裂且伴隨有炎性細胞浸潤；相對模型組，低、中、高劑量藥物組大鼠心肌組織中上述細胞形態(tài)變化明顯改善，見圖1。模型組大鼠心肌組織病理積分（3.55±0.42）較對照組（0.09±0.08）明顯升高，低劑量藥物組（2.63±0.36）、中劑量藥物組（1.86±0.25）、高劑量藥物組（0.79±0.11）大鼠心肌組織病理積分逐漸降低，且均低于模型組（n=10，F(xiàn)=248.641，P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes of myocardial tissue in each group(HE staining,×100)圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×100）

2.2 人參皂苷Rg1對大鼠心功能的影響模型組大鼠心功能指標(biāo)LVDP、?dP/dtmax以及+dP/dtmax較對照組明顯降低，LVEDP明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量藥物組LVDP、?dP/dtmax和+dP/dtmax顯著升高，而LVEDP顯著降低（P＜0.05），且隨著藥物劑量的升高，上述變化越明顯。見表1。

2.3 人參皂苷Rg1對大鼠血清中BNP、cTnI和CK?MB含量的影響與對照組比較，模型組大鼠血清中BNP、cTnI和CK?MB含量均明顯升高（P＜0.05）；但低、中和高劑量藥物組BNP、cTnI和CK?MB含量明顯低于模型組（P＜0.05），且隨著藥物劑量的升高，BNP、cTnI和CK?MB含量降低越明顯。見表2。

2.4 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平的影響與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量藥物組IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平較模型組明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3。

Tab.1 Comparison of cardiac function indexes between five groups of rats表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（n=10，x±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of BNP,cTnI and CK-MB between five groups of rats表2 各組大鼠血清中BNP、cTnI和CK-MB含量比較（n=10，x±s）

Tab.3 Comparison of mRNA levels of IL-6,IL-1βand TNF-αin myocardial tissue between five groups of rats表3 各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平比較 （n=10，x±s）

2.5 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2和Bax表達的影響模型組中cleaved caspase?3/procaspase?3和Bax/Bcl?2比值較對照組明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量藥物組中cleaved caspase?3/procaspase?3和Bax/Bcl?2比值逐漸降低，且均低于模型組（P＜0.05）。見表4、圖2。

Tab.4 Comparison of cleaved caspase-3/procaspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio in myocardial tissue of rats between five groups表4 各組大鼠心肌組織中cleaved caspase-3/procaspase-3和Bax/Bcl-2比值比較 （n=10，x±s）

Fig.2 The expression of procaspase?3,cleaved caspase?3,Bcl?2 and Bax protein detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測procaspase?3、cleaved caspase?3、Bcl?2和Bax蛋白表達

2.6 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中TLR4/NF?κB信號通路的影響模型組大鼠心肌組織中TLR4/NK?κB信號通路相關(guān)蛋白TLR4、MyD88和p?NF?κB p65表達水平較對照組明顯升高（P＜0.05），低、中和高劑量藥物組中TLR4、MyD88和p?NF?κB p65蛋白表達水平較模型組明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表5、圖3。

Tab.5 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway related protein expression levels in myocardial tissue of rats between five groups表5 各組大鼠心肌組織中TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 （n=10，x±s）

Fig.3 The expression of TLR4/NF?κB signaling pathway related proteins detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測TLR4/NF?κB信號通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

3.1 人參皂苷Rg1對重癥肺炎心肌損傷的保護作用重癥肺炎是一種常見的臨床危重癥，心肌損傷作為其常見并發(fā)癥可導(dǎo)致患者心功能障礙甚至心力衰竭［11］。本研究在構(gòu)建的重癥肺炎大鼠中發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織病理積分升高，心功能指標(biāo)LVEDP升高，而LVDP、?dP/dtmax和+dP/dtmax降低；同時，大鼠血清中心肌損傷指標(biāo)cTnI、BNP和CK?MB含量明顯升高。結(jié)果表明，在構(gòu)建的重癥肺炎大鼠中，其心肌組織明顯受損。以低、中和高劑量的人參皂苷Rg1干預(yù)后發(fā)現(xiàn)大鼠LVDP、?dP/dtmax、+dP/dtmax水平逐漸升高，而心肌組織病理積分、LVEDP和cTnI、BNP、CK?MB含量逐漸降低。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可呈劑量依賴性減輕重癥肺炎大鼠心肌損傷，提示其對重癥肺炎心肌損傷具有一定的保護作用。

3.2 人參皂苷Rg1可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)重癥肺炎患者處于一種嚴重的炎癥狀態(tài)，重癥肺炎合并心肌損傷患者的炎癥反應(yīng)隨著病原菌的復(fù)制和免疫力的下降，持續(xù)擴散至包括心肌組織在內(nèi)的全身各個組織器官，而炎性細胞浸潤又可引起心肌細胞變性壞死和凋亡，最終導(dǎo)致心肌組織損傷［12］。研究顯示，人參皂苷Rg1可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR?γ）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來改善大鼠心肌缺血再灌注后的心律失常，還可通過降低鈣敏感受體抑制心肌細胞凋亡［13?14］。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎大鼠的心肌組織中促炎因子IL?6、IL?1β、TNF?αmRNA表達水平和凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved caspase?3/procaspase?3、Bax/Bcl?2比值明顯升高，而給予低、中和高劑量的人參皂苷Rg1干預(yù)后，大鼠心肌組織中上述指標(biāo)變化明顯受到抑制。結(jié)果表明人參皂苷Rg1可抑制心肌組織炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡，進而發(fā)揮對重癥肺炎心肌損傷的保護作用。

3.3 人參皂苷Rg1可抑制TLR4/NK?κB信號通路活化TLR4是Toll樣受體家族成員，可通過識別相應(yīng)配體經(jīng)MyD88激活NK?κB炎癥通路促進炎性因子IL?6和IL?10等介質(zhì)釋放，在天然免疫、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，與心肌組織損傷的發(fā)生密切相關(guān)［15?17］。研究顯示，人參皂苷Rg1可抑制TLR4/NK?κB信號通路的活化［18?19］。本研究發(fā)現(xiàn)重癥肺炎大鼠的心肌組織中TLR4、MyD88和p?NK?κB p65蛋白表達水平明顯升高；給予人參皂苷Rg1干預(yù)后，TLR4、MyD88和p?NK?κB p65蛋白表達水平呈劑量依賴性降低，表明人參皂苷Rg1可抑制重癥肺炎大鼠心肌組織中TLR4/NK?κB信號通路的活化，提示其可能通過抑制該通路活化減輕炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡，進而起到保護重癥肺炎心肌損傷的作用。

綜上所述，人參皂苷Rg1可通過減輕炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡對重癥肺炎心肌損傷發(fā)揮保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4/NK?κB通路活化有關(guān)。本研究初步揭示了人參皂苷Rg1保護重癥肺炎心肌損傷的作用通路，但是否還與調(diào)控其他通路有關(guān)仍有待進一步探討。