黃芪總皂苷對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓作用探討

李旭東，馬勇，鄧潤(rùn)鵬，蒼雪玉，吳飛燕，李永濤，金海峰

目前，世界衛(wèi)生組織將肺動(dòng)脈高壓分為動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓、與左心疾病相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓、缺氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）、由肺動(dòng)脈阻塞引起的肺動(dòng)脈高壓、未知和（或）多因素所致肺動(dòng)脈高壓5個(gè)亞類。研究顯示，肺部疾病和（或）長(zhǎng)期低氧造成的肺部持續(xù)性低氧狀態(tài)可引起HPH［1］。HPH的病理特點(diǎn)是肺動(dòng)脈的病理性重構(gòu)及肺動(dòng)脈壓力的升高，進(jìn)而導(dǎo)致右心室壓力的超負(fù)荷，甚至右心室衰竭［2］。目前，臨床尚缺乏有效治療HPH的藥物。黃芪（astragali radix）為傳統(tǒng)中草藥，其有效藥用成分是黃芪總皂苷（astragaloside，AST）、多糖及黃芪總黃酮［3?4］。柳濟(jì)成等［5］證實(shí)，黃芪注射液可通過調(diào)節(jié)大鼠肺組織中的內(nèi)皮素?1和一氧化氮水平，治療大鼠HPH。然而，有關(guān)黃芪中最有效藥用成分之一的AST對(duì)HPH的治療作用及其可能機(jī)制的研究少見報(bào)道。本研究通過建立HPH模型大鼠并給予AST，研究其對(duì)HPH模型大鼠肺動(dòng)脈壓力及肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料AST［紫外分光光度法（UV）≥98%］購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J30N9T76378。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（Nox2）多克隆抗體、兔抗Nox4單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購自ABclonal Technology。小鼠抗α?平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）單克隆抗體、兔抗β?actin單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組28只SPF級(jí)雄性SD大鼠（體質(zhì)量180～200 g，7周齡）購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黑）2016?001?001］。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法 均 分為對(duì)照組、HPH組、HPH+AST15 mg/（kg·d）組（HPH+AST15組）、HPH+AST45 mg/（kg·d）組（HPH+AST45組）。采用間斷式常壓低氧建立大鼠HPH模型。HPH組、HPH+AST15組、HPH+AST45組大鼠置于10%O2體積分?jǐn)?shù)的低氧箱中，低氧時(shí)間為18 h/d，持續(xù)28 d。AST利用DMSO配制成母液，用無菌生理鹽水進(jìn)一步配制成終濃度為0.5%的DMSO，腹腔注射于HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠。HPH組大鼠腹腔注射同等體積的含有0.5% DMSO的生理鹽水。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)28 d后，各組大鼠行腹腔注射麻醉，并將充滿肝素的PE導(dǎo)管經(jīng)大鼠右側(cè)頸靜脈插入到右心室，利用BL?420S生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈壓力的指標(biāo)右心室收縮壓力（right ventricle systolic pressure，RVSP）。

1.2.3 肺組織HE染色將大鼠肺組織剪成3 mm×3 mm的組織塊，并進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，再將組織塊切成4μm厚的切片，進(jìn)行HE染色。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并測(cè)量肺動(dòng)脈的血管總面積、中膜面積、外徑以及內(nèi)徑。肺動(dòng)脈厚度百分比（WT）=（外徑?內(nèi)徑）/外徑×100%；肺動(dòng)脈面積百分比（WA）=中膜面積/血管面積×100%。

1.2.4 右心室肥厚指標(biāo)檢測(cè)游離出大鼠心臟，去除左、右心房，將心室分成右心室（right ventricle，RV）和左心室+室間隔（left ventricle plus septum，LV+S），并分別稱質(zhì)量。計(jì)算右心室肥厚程度：RV/（LV+S）。

1.2.5 肺組織免疫熒光染色肺組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、血清封閉，行免疫熒光染色觀察α?SMA，DAPI行細(xì)胞核染色。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量α?SMA的光密度（OD）值，判斷肺動(dòng)脈增生情況。

1.2.6 各組SOD、CAT及MDA水平檢測(cè)抽取大鼠頸外動(dòng)脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，提取血清；取適量大鼠肺組織制成10%勻漿，12 000 r/min離心10 min，提取上清液。參照檢測(cè)試劑盒說明書，利用分光光度法檢測(cè)大鼠血清及肺組織中的SOD、CAT及MDA水平。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)肺組織Nox2和Nox4蛋白提取大鼠肺組織總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白經(jīng)SDS?PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶封閉。孵育一抗，Nox2（1∶1 000），Nox4（1∶1 000），β?actin（1∶3 000），4℃過夜，洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶3 000）1.5 h，洗膜。利用ECL發(fā)光試劑盒，檢測(cè)大鼠肺組織中Nox2和Nox4蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AST對(duì)大鼠RVSP及右心室肥厚的影響與對(duì)照組比較，HPH組大鼠RVSP和RV/（LV+S）均升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組 大 鼠RVSP和RV/（LV+S）均 降 低（P＜0.05），HPH+AST15組和HPH+AST45組RVSP和RV/（LV+S）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 RVSP and RV/(LV+S)in the four rat groups表1 各組大鼠RVSP和RV/（LV+S） （n=7，x±s）

2.2 AST對(duì)大鼠肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建的影響大鼠肺組織HE染色及α?SMA免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HPH組WT、WA及α?SMA水平均升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠WT、WA及α?SMA水平均降低（P＜0.05），其中HPH+AST45組較HPH+AST15組WT、WA及α?SMA水平更低（P＜0.05），見表2，圖1、2。

Tab.2 Comparison of WT,WA andα-SMA OD value of pulmonary arteries between the four rat groups表2 各組大鼠肺動(dòng)脈WT、WA及α-SMA情況比較（n=7，x±s）

2.3 各組肺組織及血清中SOD、CAT、MDA比較與對(duì)照組比較，HPH組肺組織和血清SOD和CAT水平均降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組肺組織和血清SOD和CAT水平升高，MDA水平降低（P＜0.05）。HPH+AST45組肺組織MDA水平較HPH+AST15組更低（P＜0.05），而HPH+AST15組和HPH+AST45組血清中的SOD、CAT、MDA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.4 AST對(duì)大鼠肺組織中Nox2和Nox4蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，HPH組肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而HPH+AST45組較HPH+AST15組Nox2和Nox4蛋白表達(dá)水平亦降低（P＜0.05），見表4、圖3。

Tab.3 Comparison of the SOD,CAT and MDA levels both in lung tissues and in serum between the four rat groups表3 各組大鼠肺組織及血清中的SOD、CAT、MDA水平比較 （n=7，x±s）

Tab.4 The protein levels of Nox2 and Nox4 in the different rat groups表4 各組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達(dá)（n=4，x±s）

Fig.3 The protein levels of Nox2 and Nox4 in the different rat groups圖3 各組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達(dá)

3 討論

黃芪作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥用于治療各種相關(guān)疾病已有上千年歷史［6］。AST是黃芪中皂苷類化合物的總提取物，目前已被證明其對(duì)心血管疾病、腦血管疾病、腎臟損傷、肝癌、肺纖維化、糖尿病等均具有治療作用［3，7］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HPH組大鼠RVSP、RV/（LV+S）、WT、WA及α?SMA水平均升高，表明HPH組大鼠出現(xiàn)明顯的肺動(dòng)脈壓力升高、右心室肥厚、肺動(dòng)脈的增生和結(jié)構(gòu)重建，HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠RVSP、RV/（LV+S）、WT、WA及α?SMA水平較HPH組大鼠均明顯降低，證明AST能夠有效抑制大鼠HPH的病理進(jìn)展。

在HPH的病理發(fā)展過程中，低氧誘導(dǎo)而過量產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞的過度增生，從而造成肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建、肺動(dòng)脈管壁的增厚、管腔變狹小、肺動(dòng)脈壓力的進(jìn)行性升高以及右心室的肥厚［8］。研究顯示，在低氧條件下，生物體內(nèi)的線粒體、NADPH氧化酶系統(tǒng)等會(huì)產(chǎn)生大量過氧化氫（H2O2）、超氧化物陰離子（O2·?）等ROS物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)參與肺血管張力的改變、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過度增生等血管病變發(fā)展過程［9?10］。在促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生方面，ROS可作為第二信使激活磷脂酰肌醇3?激酶/蛋白激酶B（PI3K?Akt），絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶（MAPK?ERK）等與增殖相關(guān)的信號(hào)通路，從而在低氧誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞過度增生過程中發(fā)揮著重要作用［11］。NADPH氧化酶包括7個(gè)亞型，肺組織主要表達(dá)Nox1、Nox2、Nox4及Nox5亞型［12］。其中，Nox2和Nox4在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、肺動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞以及肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，并且在ROS的產(chǎn)生過程中起著主導(dǎo)性作用［13］。為應(yīng)對(duì)過量ROS對(duì)組織或細(xì)胞的損傷，機(jī)體分泌的SOD和CAT等抗氧化酶在清除過量ROS及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要作用［14］。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的標(biāo)志物，其水平可間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激的損傷程度。在HPH的病理發(fā)展過程中，長(zhǎng)期低氧會(huì)造成機(jī)體抗氧化酶的功能失常及活性降低，從而導(dǎo)致清除ROS能力減弱，引起MDA水平升高。因此，在HPH的病理發(fā)展過程中，如何有效抑制低氧誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活性，從而降低ROS的過量產(chǎn)生，并提高抗氧化酶活性，是防治HPH的有效方法。Ma等［15］研究顯示，在心肌缺血模型大鼠中，AST能夠通過提高大鼠體內(nèi)SOD水平，降低MDA水平，從而抑制ROS對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。另外，Qiu等［16］證實(shí)在高同型半胱氨酸血癥模型大鼠中，AST可通過降低大鼠血管ROS水平，并提高SOD和CAT水平，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，AST不但能夠有效提高SOD和CAT兩種抗氧化酶水平，降低MDA水平，而且能夠有效抑制低氧誘導(dǎo)的Nox2和Nox4兩種氧化酶在大鼠肺組織中的高表達(dá)，提示AST抑制大鼠HPH的病理進(jìn)展可能是通過降低Nox2和Nox4的表達(dá)及改善SOD和CAT活性來實(shí)現(xiàn)的。另外，HPH+AST45組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達(dá)水平和MDA水平均低于HPH+AST15組，證實(shí)AST在大鼠肺組織中降低氧化酶活性及抑制氧化損傷方面，高劑量作用效果更加顯著。

綜上所述，AST作為一種良好的抗氧化物質(zhì)，可通過抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)HPH模型大鼠肺動(dòng)脈壓力的升高、肺動(dòng)脈增生及結(jié)構(gòu)重建產(chǎn)生良好的抑制作用。

Fig.1 HE staining of pulmonary arteries in the different rat groups(×400)圖1各組大鼠肺動(dòng)脈HE染色（×400）

Fig.2 Theα-SMA immunofluorescence staining of pulmonary arteries in the different rat groups(×400)圖2各組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA免疫熒光染色（×400）