DNA分析技術(shù)在單基因遺傳病產(chǎn)前診斷中的研究進(jìn)展

劉 寧 王 超 王芳芳 劉 羽 張玉紅 張 婷 田婷婷 劉梅梅

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(150081)

單基因遺傳病是指受一對(duì)等位基因控制的遺傳病,因遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，又稱孟德?tīng)栠z傳病。單基因遺傳病主要臨床表現(xiàn)為智力障礙、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、器官發(fā)育異常等，此類遺傳病病種多、危害重且無(wú)法根治，給社會(huì)及家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)，故減少此類患兒的出生是預(yù)防和控制遺傳病出生缺陷的關(guān)鍵。對(duì)于有單基因遺傳病患兒出生史的家系，在先證者致病基因及突變類型明確的基礎(chǔ)上，可通過(guò)產(chǎn)前診斷防止患兒的出生。產(chǎn)前診斷是指在出生前對(duì)胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)診斷，為能否繼續(xù)妊娠提供相應(yīng)科學(xué)依據(jù)。產(chǎn)前診斷可分為胚胎植入前遺傳學(xué)診斷和妊娠期產(chǎn)前診斷?；驒z測(cè)是在DNA水平對(duì)某一基因進(jìn)行分析，從而對(duì)特定的疾病進(jìn)行診斷?；驒z測(cè)是確診單基因遺傳病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)，主要包括DNA分析技術(shù)和其相關(guān)生化檢測(cè)技術(shù)。目前已實(shí)現(xiàn)各種產(chǎn)前診斷方式與多種基因檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合,在妊娠期對(duì)胎兒?jiǎn)位蜻z傳病進(jìn)行診斷[1-3]，本文綜述單基因遺傳病產(chǎn)前診斷相關(guān)DNA分析技術(shù)和其相關(guān)生化檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，為臨床單基因遺傳病產(chǎn)前診斷的方案制定提供一定的思路。

1 單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷方式

單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷方式有胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-M)、介入性產(chǎn)前診斷和無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)。PGT-M是一種用于識(shí)別受單基因缺陷影響的胚胎診斷技術(shù)，通過(guò)了解胚胎目標(biāo)基因的基因型，選擇沒(méi)有患病風(fēng)險(xiǎn)的胚胎進(jìn)行移植，以避免子代發(fā)病。但是，PGT-M存在可供檢測(cè)的遺傳物質(zhì)少和擴(kuò)增偏差容易引起基因脫扣等相關(guān)問(wèn)題[4-5]。目前，PGT-M已成功應(yīng)用于臨床單基因病的植入前檢測(cè)[6-7]，但所有接受PGT-M技術(shù)的病例都應(yīng)在妊娠期接受介入性產(chǎn)前診斷以明確患病可能[8]。目前較常用的介入性產(chǎn)前診斷按取材方式不同分為絨毛穿刺、羊水穿刺、臍血穿刺以及胎兒鏡活檢等。這些方法只能在妊娠的特定時(shí)間窗內(nèi)使用并且有流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，羊膜腔穿刺因流產(chǎn)率更低和成功率更高成為首選的方法[9]。相比介入性產(chǎn)前診斷，NIPT借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)孕婦外周血漿中的胎兒游離DNA(cffDNA)測(cè)序，具有更高的效益成本和更低的正常胎兒丟失率，不僅可以篩查胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)率[10-11]，還可以對(duì)多種單基因遺傳病進(jìn)行產(chǎn)前篩查檢測(cè)[12-13]。但NIPT只是一項(xiàng)篩查技術(shù)，存在著一定假陽(yáng)性率和假陰性率[14]，而由此篩查出來(lái)的陽(yáng)性病例仍需要進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷以明確胎兒是否患病。近年來(lái)，隨著單細(xì)胞基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，胎兒細(xì)胞的基因信息更加完整和準(zhǔn)確，利用從母體(外周血或?qū)m頸)分離出胎兒細(xì)胞進(jìn)行單基因病診斷擁有巨大前景，如已有利用孕婦宮頸中分離滋養(yǎng)層細(xì)胞診斷出胎兒患有囊性纖維化或脊髓性肌萎縮癥的研究[15-16]。相比cffDNA，其優(yōu)勢(shì)在于可提供的遺傳信息更全面，可選擇的檢測(cè)手段更多，適用范圍更廣等。但是仍有很多問(wèn)題需要解決，如母源污染、嵌合性問(wèn)題、基因脫扣問(wèn)題、分離富集技術(shù)等問(wèn)題。目前，利用胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷仍處于實(shí)驗(yàn)階段，評(píng)估其是否能真正超越和取代目前的基于cffDNA的NIPT檢測(cè)，成為診斷技術(shù)，仍需大量臨床研究數(shù)據(jù)的積累。

2 單基因遺傳病相關(guān)DNA分析技術(shù)

2.1 Sanger測(cè)序技術(shù)

1977年Sanger等[17]發(fā)明雙脫氧鏈末端合成終止法即Sanger測(cè)序技術(shù)，其原理是利用一種DNA聚合酶延伸結(jié)合在待測(cè)DNA模板上的引物，直到摻入1種鏈終止核苷酸測(cè)序才終止。在過(guò)去的 30 年里，Sanger測(cè)序技術(shù)因測(cè)序讀長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高被廣泛運(yùn)用于科研和臨床工作的基因檢測(cè)中，特別適用于已明確致病基因的遺傳性單基因疾病基因診斷和產(chǎn)前診斷[18]。Sanger測(cè)序這種直接測(cè)序方法具有高度的準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)，對(duì)于有致病基因位點(diǎn)明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測(cè)是非常經(jīng)濟(jì)和高效的。例如，臨床上采用Sanger直接測(cè)序FGFR2基因證實(shí)單基因Apert綜合征和直接測(cè)序TCOF1基因可以檢出多達(dá)90%的與Treacher Collins綜合征相關(guān)的突變。到目前為止，Sanger測(cè)序仍然是作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，也是二代測(cè)序技術(shù)(NGS)基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和正常對(duì)照組驗(yàn)證的主要手段[19]。雖然Sanger測(cè)序具有高度的分析準(zhǔn)確性，但其準(zhǔn)確性還取決于測(cè)序儀器以及測(cè)序條件的設(shè)定。另外，Sanger測(cè)序離不開PCR擴(kuò)增，需要放射性同位素標(biāo)記，只能分析單個(gè)DNA片段，通量小，不能檢測(cè)出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類型，無(wú)法滿足大規(guī)模測(cè)序的要求；操作繁瑣且自動(dòng)化程度低，檢測(cè)速度慢；成本相對(duì)較高。

2.2 二代測(cè)序技術(shù)

21世紀(jì)高通量測(cè)序技術(shù)的問(wèn)世為NGS奠定了基礎(chǔ)，測(cè)序技術(shù)步入一個(gè)新時(shí)代。主要包括全基因組重測(cè)序、全外顯子組測(cè)序(WES)和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。NGS的主要優(yōu)勢(shì)在于通量高、可定量、速度快、成本低和分辨率高等，聚合酶或連接酶直接體外合成和測(cè)序同時(shí)合成同時(shí)測(cè)序[20]，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于PGT-M、NIPT及介入性產(chǎn)前診斷領(lǐng)域[21-23]。但NGS仍存在諸多問(wèn)題，比如仍無(wú)法擺脫P(yáng)CR擴(kuò)增前后讀取序列較短造成后期生物信息學(xué)析困難以及前期文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜等。Sanger測(cè)序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。對(duì)于沒(méi)有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例還要依靠具有高通量測(cè)序能力的NGS?？傮w而言，NGS技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位。不同的測(cè)序技術(shù)在測(cè)序范圍、數(shù)據(jù)分析量，以及測(cè)序費(fèi)用和時(shí)間等方面又有很大差別，如果選擇適合的方法，對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究將起到事半功倍的作用。

2.2.1SNP連鎖分析2010 年，Lo等[24]利用二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)孕婦外周血游離DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)同一染色體上相鄰的SNP位點(diǎn)構(gòu)建單體型，并進(jìn)行定量分析，建立相對(duì)單體型分析(RHDO)的方法，通過(guò)純合子第1胎確定與致病位點(diǎn)連鎖的SNP，并分別確定父母雙親的單體型，對(duì)孕婦外周血測(cè)序結(jié)果中父親和母親的1個(gè)單體型內(nèi)多個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行序貫概率比檢驗(yàn)，推斷胎兒可能的基因型，增加了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，使結(jié)果更可靠。2013年，Chen等[25]開發(fā)了一種借助核心家系體型連鎖分析的單基因遺傳病的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法。針對(duì)與致病位點(diǎn)連鎖的 SNP設(shè)計(jì)探針進(jìn)行靶向捕獲，基于先證者的基因型構(gòu)建父母親的單體型，繼而對(duì)孕婦的血漿游離DNA進(jìn)行深度測(cè)序計(jì)算胎兒的可能基因型。此方法不受突變類型影響，不受復(fù)雜重復(fù)結(jié)構(gòu)限制，準(zhǔn)確性高，適用于包括杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、脊髓型肌萎縮、血友病B在內(nèi)的多種單基因遺傳病的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[26-29]。SNP連鎖分析中雙親單倍型的構(gòu)建核心家系分析的方法僅適用于有先證者存在的家系，對(duì)于臨床取樣以及科學(xué)研究都增加了諸多的限制，也不適用于未知突變的檢測(cè)。

2.2.2全外顯子測(cè)序技術(shù)全外顯子測(cè)序(WES)只對(duì)含有編碼區(qū)的外顯子進(jìn)行測(cè)序，這些外顯子涵蓋 85%的單基因病致病位點(diǎn),迄今為止，WES已成功發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種遺傳病的致病基因[30-32]。此外，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前診斷中 WES 比染色體微陣列分析(CMA)能多檢測(cè)出8.5%的致病性遺傳變異[33]。WES具有覆蓋范圍廣、測(cè)序成本低及處理時(shí)間減少等優(yōu)勢(shì)；WES的局限性在于檢測(cè)結(jié)構(gòu)變化的能力有限，不能完全覆蓋某些蛋白質(zhì)編碼區(qū)域和潛在的功能性非編碼元素，不能可靠地檢測(cè)所有類型的遺傳變異，如拷貝數(shù)變化、低比例嵌合、非整倍性、結(jié)構(gòu)性染色體重排或三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增等[34]。因此，不建議將WES作為常規(guī)產(chǎn)前診斷方法推廣應(yīng)用，還應(yīng)該進(jìn)行核型分析和(或)CMA。此外，產(chǎn)前WES的成本尚未正式評(píng)估，盡管測(cè)序本身的成本正在迅速下降，但解釋其臨床意義不明變異和偶然發(fā)現(xiàn)基因突變的倫理問(wèn)題所需的時(shí)間和人力是巨大的。相信通過(guò)產(chǎn)前診斷臨床醫(yī)生、遺傳學(xué)專家和其他相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业墓餐?，WES會(huì)更好地服務(wù)于臨床。

2.3 三代測(cè)序技術(shù)

2.3.1納米孔測(cè)序技術(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)，是一種基于電信號(hào)測(cè)序的新型技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于不需要擴(kuò)增或修飾、長(zhǎng)閱讀長(zhǎng)度、儀器簡(jiǎn)單、使用成本低、測(cè)序速度快，并能對(duì)RNA進(jìn)行直接測(cè)序；缺點(diǎn)是不能重復(fù)測(cè)序、錯(cuò)誤率高。研究表明，盡管誤差率較高，但納米孔測(cè)序的表現(xiàn)可能與單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)一樣好[35]；單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)和納米測(cè)序技術(shù)在新基因組組裝方面表現(xiàn)相似[36]。相比單分子實(shí)時(shí)測(cè)序限制于技術(shù)本身，納米孔讀取長(zhǎng)度只取決于測(cè)序DNA分子的長(zhǎng)度。此外，納米孔測(cè)序技術(shù)還可以對(duì)RNA序列直接測(cè)序[37]。目前在臨床上診斷為單基因病的患者中有很多患者在全外顯子測(cè)序上得到陰性結(jié)果，納米測(cè)序技術(shù)則能發(fā)現(xiàn)未確診或被誤診患者的基因變異情況[38]。此外，納米測(cè)序技術(shù)加速了微生物和臨床相關(guān)的新型病毒的鑒定[39-40]，提高及擴(kuò)展了臨床診斷效率。雖然目前納米孔測(cè)序技術(shù)尚處于研究中，但有望在不久的將來(lái)人們能利用其以最快的速度得到人類基因組相關(guān)信息，并有望用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域。

2.3.2單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)近幾年，以單分子測(cè)序?yàn)樽畲筇攸c(diǎn)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序已登上測(cè)序技術(shù)舞臺(tái)。相比Sanger測(cè)序和NGS，單分子實(shí)時(shí)測(cè)序過(guò)程無(wú)需PCR擴(kuò)增，邊合成邊測(cè)序，具有測(cè)序時(shí)間更短、精確性更高、成本更低廉、靈活性更強(qiáng)和通量更高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)為 酶的活性與穩(wěn)定性差、單分子信號(hào)會(huì)變成噪音增加熒光背景、延展DNA同時(shí)難以避免二聚體結(jié)構(gòu)等。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序憑借讀取序列超長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)可進(jìn)行更廣泛的基因檢測(cè)，能發(fā)現(xiàn)NGS不能發(fā)現(xiàn)的重復(fù)基因組和結(jié)構(gòu)變異區(qū)域[41-42]。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)包括模式生物在內(nèi)的多個(gè)物種的基因組測(cè)序，從簡(jiǎn)單的原生物基因組到復(fù)雜的高等動(dòng)植物基因組[43-44]，以及最受重視的人類基因組。利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序?qū)膊∠嚓P(guān)基因組區(qū)域進(jìn)行研究，是精準(zhǔn)醫(yī)療的一大研究方向，未來(lái)可能會(huì)成為一種標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)診斷工具。

3 單基因遺傳病相關(guān)DNA分析的生化檢測(cè)技術(shù)

3.1 數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR(dPCR)是一種對(duì)微量模板進(jìn)行絕對(duì)定量分析的技術(shù)，與傳統(tǒng)定量PCR相比具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性，可以憑借微量胎兒cffDNA檢測(cè)單基因遺傳病，有可能成為胎兒產(chǎn)前基因診斷的重要研究工具。目前ddPCR在單基因病產(chǎn)前診斷應(yīng)用更為廣泛。ddPCR是一種新型的、可對(duì)DNA或RNA進(jìn)行絕對(duì)定量的檢測(cè)技術(shù)，每個(gè)微滴作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增后利用探針上的特異性熒光信號(hào)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)泊松分布原理，計(jì)算出原始樣本的濃度。Camunas-Soler等[45]應(yīng)用ddPCR技術(shù)成功診斷出9例單基因遺傳病，包括血友病、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺陷癥和囊性纖維化等。Gruber等[46]應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)4對(duì)神經(jīng)纖維瘤NF1突變基因和4對(duì)囊性纖維化CFTR突變基因的夫婦，研究結(jié)果顯示所有母體血漿樣本中都正確地評(píng)估了父源性突變基因的情況。該技術(shù)也被用在血友病F8和F9基因突變[47]的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中。數(shù)字 PCR技術(shù)通過(guò)單分子擴(kuò)增降低了背景DNA的影響，具有超高靈敏度，可用于低濃度DNA的檢測(cè)。但作為一項(xiàng)新興技術(shù)，ddPCR檢測(cè)胎兒染色體異常及單基因病尚未建立成熟的方法，需要更多的病例進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2 環(huán)化單分子擴(kuò)增和重測(cè)序技術(shù)

2015 年，Lv等[48]研發(fā)了環(huán)化單分子擴(kuò)增和重測(cè)序技術(shù)(cSMART)，對(duì)4個(gè)威爾遜病家族的ATP7B基因突變進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷(NIPD)并得出與介入性產(chǎn)前診斷相同的結(jié)果。cSMART是一種對(duì)血漿中游離DNA中低比例突變進(jìn)行定性和絕對(duì)定量的新型檢測(cè)技術(shù)。cSMART可以消除潛在的PCR擴(kuò)增偏倚，精確量化原始血漿樣本中突變等位基因的比例以保證檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確性。cSMART不僅可用于評(píng)估胎兒染色體濃度等,還應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中胎兒?jiǎn)位蜻z傳病的檢測(cè)及腫瘤靶向用藥及療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[49-51]。cSMART檢測(cè)只需要了解親代致病突變或相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的情況，是一種有前途的基于實(shí)驗(yàn)室的單基因疾病的NIPD通用策略。但在一些疾病中，致病突變涉及大的缺失或三核苷酸的擴(kuò)增，則會(huì)影響cSMART的準(zhǔn)確性和靈敏度。這需要對(duì)與常見(jiàn)單基因疾病相關(guān)的一系列其他類型的致病突變和/或連鎖SNPs進(jìn)行進(jìn)一步研究，以確定cSMART對(duì)單基因疾病NIPT的總體效用。

4 結(jié)語(yǔ)

在出生缺陷中，單基因遺傳病占有重要的比重。遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷能夠最大程度地減少此類患兒的出生,同時(shí)能夠?qū)位虿〖彝ヌ峁┯袃r(jià)值的生育指導(dǎo)?；驒z測(cè)是確診單基因病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)。對(duì)于單基因病，基因診斷特別是DNA測(cè)序技術(shù)被公認(rèn)是確診該類疾病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，它可以在基因水平甚至在單個(gè)堿基發(fā)生改變的情況下作出明確診斷，還可以在全基因組水平查出任何堿基的改變。近十幾年來(lái)，測(cè)序技術(shù)取得了前所未有的進(jìn)步，在基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)中已日益顯出廣闊的應(yīng)用前景。從測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程來(lái)看，它經(jīng)歷了從簡(jiǎn)單到復(fù)雜，從單一到全面和多功能，從時(shí)間長(zhǎng)、成本高、通量低、手工操作到快速、廉價(jià)、高通量、自動(dòng)化，從多細(xì)胞到單分子、用量多到用量少的過(guò)程。產(chǎn)前診斷技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用不同特點(diǎn)的基因測(cè)序技術(shù),有利于疊加檢測(cè)效益,從而最大程度地減少單基因病患兒的出生。