人類胰腺導(dǎo)管腺癌三維類器官模型研究進(jìn)展

耿宏智 蘇力擔(dān)卡扎·仇曼 迪力旦·納斯?fàn)?徐佳琪 陳啟龍

1廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣人民醫(yī)院肛腸科 536199；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰腺外科,新疆醫(yī)科大學(xué)疾病和動物模型國家重點實驗室，烏魯木齊 830054耿宏智與蘇力擔(dān)卡扎·仇曼對本文有同等貢獻(xiàn)

0 引 言

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDA）是一種最致命的惡性腫瘤，2019 年美國PDA發(fā)病率占胰腺癌發(fā)病率的90%以上，預(yù)計在2030 年美國胰腺癌病死率將僅次于肺癌[1-2]。在臨床研究中化學(xué)藥物治療（化療）被證明可明顯提高PDA 患者的中位生存期，但患者接受傳統(tǒng)化療反應(yīng)率僅為23%～31%[3-4]。如何提高PDA 化療敏感性是一個亟待解決的臨床難題。不幸的是PDA 化療敏感性存在顯著的異質(zhì)性，常常導(dǎo)致不必要的治療和額外的毒副作用。因此，在手術(shù)治療效果有限的條件下，目前腫瘤精準(zhǔn)治療離不開兩大關(guān)鍵性突破：①基因測序，通過分析大量癌癥患者的基因異常數(shù)據(jù)，篩選出對化療藥物敏感的靶點，這一方法已成為現(xiàn)實。但其操作復(fù)雜，費用較高，難以做技術(shù)推廣，故缺乏廣泛的臨床驗證。②通過分析大量的能維持PDA 細(xì)胞體內(nèi)特征的體外類器官模型，驗證對化療藥物敏感的靶點，以此來預(yù)先識別哪些患者可接受或不接受化療，使患者從化療中獲得最大收益。隨著PDA類器官的發(fā)展，這一愿望也將得以實現(xiàn)。

1 既往細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型藥敏篩查的局限性

當(dāng)前PDA 模型包括單層細(xì)胞株、患者來源的異種移植（patient-derived xenograft, PDX）和基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models,GEMMs）。癌癥基因的細(xì)胞株實驗已取得了進(jìn)步，但原位移植無法預(yù)測治療反應(yīng)[5]，也不能涵蓋患者生理相關(guān)的疾病狀態(tài)[6]。為克服這一缺陷，提出了PDX模型和GEMMs 作為PDA 臨床前模型[7]。PDX 生成PDA 需大量的組織，耗費6～12 個月來建立模型[8-9]，且費用非常昂貴。PDA GEMMs 也被作為基本生物學(xué)研究和臨床前研究的平行系統(tǒng)[10]，其可準(zhǔn)確模仿人類PDA 的病理生理特點，包括疾病入侵前的胰腺上皮內(nèi)瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）[11-12]，但PDA 缺乏豐富的血管從而妨礙了藥物輸送[6,13-14]。此外，人類PDA 和GEMMs 均具有廣泛的基質(zhì)成分，減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致難以分離和鑒定胰腺腫瘤組織中的上皮源性惡性細(xì)胞[15]。不論其來源如何，二維細(xì)胞培養(yǎng)不能復(fù)制腫瘤內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性，缺乏復(fù)雜的細(xì)胞外微環(huán)境，生長為具有非自然懸浮和黏附力的單層細(xì)胞。雖然共培養(yǎng)和transwell 實驗可解決其中一些問題，但二維細(xì)胞培養(yǎng)模型的生物轉(zhuǎn)化可能受到限制[16]。

2 PDA 類器官模型的定義

面對上述缺陷，三維培養(yǎng)的組織開始改變這種局面，由PDA 干細(xì)胞派生的三維培養(yǎng)物被稱為“類器官”[15]。首先，它必須包含一種以上來源器官的細(xì)胞類型；第二，表現(xiàn)出來源器官的一些特定功能；第三，細(xì)胞組織方式類似來源器官，這也意味著類器官以與原組織相似的方式在生成過程中建立組織器官的特點，類器官模型來自多能干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化形成的孤立器官樣組織，表現(xiàn)出多種細(xì)胞類型，自我組裝形成一個體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)[17]。因此，Boj定義類器官為器官特異性細(xì)胞的集合。這些細(xì)胞從干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育而來，并能以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)細(xì)胞分序和空間限制性的系別分化而實現(xiàn)自我組建[15]。Huang 等[17]采用電鏡和免疫熒光染色法證明PDA 類器官的自我組裝是以水凝膠為骨架，通過層粘連蛋白相接。

3 PDA 類器官模型的培養(yǎng)方法

PDA 類器官可由手術(shù)切除的人體腫瘤組織或內(nèi)鏡活檢獲取的轉(zhuǎn)移腫瘤來生成，3 d 內(nèi)可迅速生成，成功率為70%～80%，可低溫儲存，培養(yǎng)14～45 d即可用于藥敏篩查。從活檢建立類器官的能力將會促進(jìn)更大范圍PDA 患者人群的抽樣，且重復(fù)采樣可縱向追蹤患者疾病的全過程[15]。1963 年Dobrynin[18]首先報道了二維單層細(xì)胞培養(yǎng)的人類PDA。之后Agbunag 等[19]和Pylayeva-Gupta 等[20]報告了胰腺三維類器官的培養(yǎng)技術(shù)，具體包括3 方面內(nèi)容：①胰腺癌類器官的原代培養(yǎng)和長期擴(kuò)增體系的建立。②胰腺癌類器官單層培養(yǎng)體系（二維）的建立。③胰腺癌組織三維類器官培養(yǎng)和分化方案的評估。

3.1 PDA 上皮類器官模型

2013 年Huch 等[21]首先報告了由裸鼠PDA 干細(xì)胞派生的三維培養(yǎng)類器官。2015 年Boj 等[15]首先采用人類胰腺腫瘤和裸鼠的胰腺正常上皮組織建立了類器官模型。他們在培養(yǎng)基中添加多種生長因子[如表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor,EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子10（fibroblast growth factor 10,FGF10）]、形態(tài)因子（如Wnt 調(diào)節(jié)劑、Noggin）、抑制劑（如A83-01）和補(bǔ)充劑（如B27、煙酰胺、N-乙酰半胱氨酸）減少間質(zhì)，以保證小鼠和人類胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的增殖。

為避免對新鮮組織的需要，可通過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為胰腺外分泌細(xì)胞來建立類器官。Huang等[17]在水凝膠基質(zhì)上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞作為覆蓋物。培養(yǎng)基中補(bǔ)充B27、抗壞血酸、胰島素、氫化可的松、FGF2、Y267632 和全反式維甲酸（Rho 激酶抑制劑）。該法可實現(xiàn)器官的傳代和低溫保存。與Boj 等[15]的方法相反，上述媒介無需刺激Wnt 信號。利用該培養(yǎng)系統(tǒng)還可識別TP53 突變患者中轉(zhuǎn)錄因子SOX9 的胞質(zhì)定位，而其定位與不良預(yù)后相關(guān)。但該模型的缺點之一是建模費用昂貴，特別是面對多種不同的生長因子必須添加不同的媒介。

3.2 PDA 類器官共同培養(yǎng)

上述PDA 類器官培養(yǎng)僅考慮了腫瘤的上皮腔室，因此必須添加來自間質(zhì)的重要信號。將成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分別以體積比1∶2 接種于基質(zhì)膠和培養(yǎng)基的混合物中培養(yǎng)，可能有助于克服這一問題。由于存在成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)基僅需添加體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和EGF[22]。這種共同培養(yǎng)的類器官的另一個優(yōu)點是其易被量化，可使用光學(xué)成像方法來篩選藥物治療后培養(yǎng)物內(nèi)的代謝變化。

Tsai 等[23]從原發(fā)性腫瘤組織樣本消化得到細(xì)胞成分，并于基質(zhì)中培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞在基質(zhì)凝膠中形成球體，周圍環(huán)繞著腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞模擬PDA 腫瘤基質(zhì)。將人類T 細(xì)胞加入共同培養(yǎng)物中，有效模擬了浸潤性免疫細(xì)胞。這表明經(jīng)典的腫瘤類器官模型可被調(diào)整至基質(zhì)細(xì)胞，從而使腫瘤-微環(huán)境的復(fù)雜相互作用得以研究。

Li 等[24]報告了一種基于空氣-液體界面的方法，該界面由含有膠原凝膠的跨孔組成，并與空氣直接接觸。在這種條件下，無需補(bǔ)充外源性因子即可生長來自小鼠胰腺的三維類器官。培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清和質(zhì)量濃度為50 g/ml 的慶大霉素。培養(yǎng)物可存活50 d，但不能傳代。

4 其他的PDA 類器官模型

4.1 球體類器官

許多三維培養(yǎng)方法的缺點之一是很難將其擴(kuò)大至高通量分析。一種更簡單的三維培養(yǎng)方法是在甲基纖維素懸滴中創(chuàng)建胰腺癌細(xì)胞的球狀體。甲基纖維素是惰性的，故不對細(xì)胞施加細(xì)胞外基質(zhì)壓力，而僅幫助細(xì)胞聚集。然后胰腺細(xì)胞可形成自身的基質(zhì)，在不施加任何信號偏倚的情況下再現(xiàn)體內(nèi)的情況。這種方法可在生理環(huán)境下更方便地篩選藥物反應(yīng)，還可檢測不同條件下細(xì)胞內(nèi)的分子[25]。

4.2 細(xì)胞外基質(zhì)模型

PDA 患者預(yù)后差的原因之一是腫瘤通常在腫瘤轉(zhuǎn)移后的晚期才被診斷出來。即使接受手術(shù)，患者也常會因轉(zhuǎn)移性疾病復(fù)發(fā)。因此能在實驗室中有效研究PDA 的侵襲和轉(zhuǎn)移非常重要。在三維體外模型中正確模擬這種情況的關(guān)鍵是要有正確的細(xì)胞外基質(zhì)組成、促結(jié)締組織增生反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)硬度。通過改變模型中膠原蛋白的濃度，可獲得不同的細(xì)胞外基質(zhì)硬度，從而建立PDA 腫瘤內(nèi)環(huán)境[26]。

4.3 微流體

另一種建立三維模型的方法是使用微流體技術(shù)和芯片類器官技術(shù)。有文獻(xiàn)報道，在膠原包衣的HepaChip腔上生長的PDA 細(xì)胞，類似于在瓊脂糖包衣的平板上生長的三維細(xì)胞；利用媒介電泳力將細(xì)胞組裝于芯片中，灌注培養(yǎng)基后培養(yǎng)9 d，其優(yōu)點是可快速建立細(xì)胞模型，并可模擬患者腫瘤的灌注率[27]。這使得篩選患者對不同化合物的反應(yīng)變得容易，從而為患者制定臨床個性化治療方法提供了可能。

4.4 腫瘤切片模型

腫瘤切片生長的一種方法是先將患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤標(biāo)本轉(zhuǎn)移至實驗室的冷介質(zhì)中（含胎牛血清和青/鏈霉素）；然后將腫瘤標(biāo)本放入細(xì)胞外鹽溶液中，例如含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgCl2、CaCl2、葡萄糖和4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液（pH7.4）；在無菌條件下將腫瘤標(biāo)本切成薄片置于基膜上，膜上可預(yù)先涂上膠原蛋白；腫瘤切片可在添加胎牛血清、谷氨酰胺、NaHCO3、HEPES 緩沖液、L-胱氨酸和抗生素的培養(yǎng)基中生長，且可維持生存能力和結(jié)構(gòu)長達(dá)6 d。腫瘤切片可能是篩選患者個性化治療方案或更詳細(xì)地檢查PDA 腫瘤基質(zhì)特征的有用方法，例如通過該法可識別免疫譜和改進(jìn)靶向治療[28]。

4.5 迷你胰腺

體外生長的胰腺三維模型是研究PDA 發(fā)展和胰腺疾病治療的寶貴工具。其可進(jìn)一步考慮其他細(xì)胞的作用，如內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞[29]。建立人類或小鼠胰腺的體外模型時，來自間質(zhì)的信號十分重要，祖細(xì)胞允許建立內(nèi)分泌和外分泌腔室。復(fù)雜的胰腺類器官已可通過培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)產(chǎn)生的祖細(xì)胞培養(yǎng)而來，細(xì)胞于分別添加FGF10、肝素、R-spondin-1 蛋白、EGF 和Rho 相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632 的基質(zhì)中生長。當(dāng)暴露于上述因素時，特別是在誘導(dǎo)FGF 和Notch 信號后，祖細(xì)胞分化、重新排列成胰腺結(jié)構(gòu)。類器官再現(xiàn)了胰腺的發(fā)育，細(xì)胞形成了一個極化導(dǎo)管網(wǎng)絡(luò)，頂端有腺泡細(xì)胞，中央有內(nèi)分泌細(xì)胞[30]。

5 PDA 類器官模型的侵襲性和穩(wěn)定性

已有研究者通過免疫組化、免疫熒光、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析和基因熱圖等基礎(chǔ)實驗技術(shù)驗證PDA 類器官模型的侵襲性和穩(wěn)定性[15,17]。PDX 涉及將人類組織或細(xì)胞植入人類或免疫缺陷的嚙齒動物體內(nèi)，通過類器官移植進(jìn)一步完善腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的研究方法。由于皮下異種移植通常不能準(zhǔn)確反映癌癥的侵襲或轉(zhuǎn)移，因此原位移植十分重要。

PDA 類器官的原位模型由類器官發(fā)展而來，其可產(chǎn)生均勻的腫瘤，依賴于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力，這些腫瘤可靠地生長和轉(zhuǎn)移。PDA 原位移植腫瘤類器官模型可重復(fù)早期局部侵襲性PanIN 樣病灶和轉(zhuǎn)移性腫瘤形成的全光譜過程，且培養(yǎng)PanIN 來源的細(xì)胞將能評價這些早期胰腺癌假定的生物標(biāo)志物。在疾病進(jìn)展期，裸鼠胰腺類器官全面的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析結(jié)果顯示基因和通路發(fā)生了改變，這些蛋白質(zhì)在人體組織的改變表明類器官模型可能會發(fā)現(xiàn)這種致命的惡性腫瘤的特征[15,17]。Boj 等[15]也分析了正常小鼠的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，結(jié)果表明PanIN 和PDA 類器官培養(yǎng)可識別特定的癌變前和惡性疾病的變化。在此之前，識別和比較腫瘤與正常組織的這些變化一直是項困難的工作，因為主要的基質(zhì)細(xì)胞在原發(fā)胰腺腫瘤中缺乏一個允許正常細(xì)胞擴(kuò)張的體外模型系統(tǒng)。值得注意的是類器官移植模型移植了一個獨特的組織模式，包括類似早期腫瘤疾病的階段，這有別于傳統(tǒng)的移植模型，快速生成侵入性腫瘤而無中間階段。此外，其他移植模型未涵蓋基膜豐富而血供少的微環(huán)境，導(dǎo)致混淆胰腺癌患者的治療反應(yīng)。相比之下，類器官移植模型可準(zhǔn)確模仿這種促進(jìn)結(jié)締組織增生性的反應(yīng)和其他人類疾病的生理相關(guān)方面[15]。類器官有潛力模擬人類疾病的發(fā)展，這項技術(shù)使研究者們能在培養(yǎng)皿中造出簡單的組織模型，無需在人體進(jìn)行試驗即可探索復(fù)雜人體組織的問題。類器官還具有潛在的藥物測試能力，未來甚至可能用于器官替換。

腫瘤精確建模的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于捕捉同質(zhì)和異形細(xì)胞間相互作用的三維組織微環(huán)境。類器官模型是研究腫瘤進(jìn)化和異質(zhì)性的一個簡單模型系統(tǒng)，其可連續(xù)操作，觀察到腫瘤發(fā)展的整個過程，因此正常組織和腫瘤組織類器官可作為一個理想的測試平臺，探討腫瘤進(jìn)化與基因組異質(zhì)性的機(jī)制。由正常胰腺培養(yǎng)的類器官具有穩(wěn)定的基因，而培養(yǎng)的腫瘤組織如實捕獲了患者腫瘤的遺傳特征，類器官移植模型將促進(jìn)體內(nèi)研究，但在傳統(tǒng)情況下胰腺癌的GEMMs 是不可用的。原位移植也可在腫瘤表型和/或基因型特征確定和/或處理后進(jìn)行，PDA 類器官模型可移植至小鼠，它們促進(jìn)組織增生反應(yīng)的生成并發(fā)展為浸潤性癌[15]。由裸鼠和人類PDA 發(fā)展的一個全面的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型將促進(jìn)新PDA 驅(qū)動基因的研究、化療治療和診斷，同時PDA 類器官模型也為患者個體化治療提供了一個實驗平臺。

6 PDA 類器官模型應(yīng)用于化療藥敏篩查

Frappart 等[31]通過免疫組化和分子表征技術(shù)系統(tǒng)比較了PDX 模型和患者類器官來源的異種移植瘤模型。隨后建立了藥物檢測平臺，并進(jìn)行了體內(nèi)驗證，結(jié)果表明在類器官中進(jìn)行小規(guī)模藥物篩選似乎是一種可行、穩(wěn)健且易于處理的疾病建模方法，可在日常臨床常規(guī)中有效地進(jìn)行反應(yīng)預(yù)測。

Tiriac 等[32]構(gòu)建了一個PDA 患者來源的類器官文庫，測序分析結(jié)果顯示PDA 類器官和相應(yīng)的腫瘤組織在基因突變范圍方面具有高度一致性?？偟膩碚f，PDA 類器官能再現(xiàn)原始腫瘤。同時，他們采用多環(huán)腺苷三磷酸腺苷法檢測了66 例PDA 類器官對常見化療藥物（吉西他濱、nab-紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑）的藥物敏感性，以及對患者反應(yīng)的交叉對照，結(jié)果表明多環(huán)腺苷三磷酸腺苷法具有較高的預(yù)測價值[32]。該研究結(jié)果還表明，特異性遺傳特征與患者對治療的反應(yīng)之間不存在相關(guān)性。相反，基于PDA 類器官藥理干擾的mRNA 標(biāo)記可成功應(yīng)用于患者，以區(qū)分對傳統(tǒng)療法有反應(yīng)的患者和無反應(yīng)的患者。特別是使用劑量響應(yīng)曲線和曲線下面積來評估個體藥物的反應(yīng)[32]。這種模擬疾病的類器官可作為一種可選擇的藥物測試系統(tǒng)，不僅可更好地解決患者對于藥物的反應(yīng)效果，還可減少動物實驗的次數(shù)。使用類器官模型大范圍篩查不可預(yù)知化合物的反應(yīng)時，多種組合和劑量的藥物也可同時進(jìn)行測試，且無需先驗性地理解潛在的分子機(jī)制，可直接進(jìn)行化學(xué)敏感性測試，從而縮短治療時間。PDA 類器官作為一種體外活體生物庫，多種不同組合的藥物和劑量可同時用于藥敏篩查，這將有助于建立不同的化療檔案，開發(fā)新的化療方案用于指導(dǎo)臨床患者的個體化治療。在實驗研究中，這種方法可能適用于建立個體化患者模型響應(yīng)的檔案，以探討PDA 類器官模型對臨床癌癥治療的指導(dǎo)作用。

7 PDA 類器官的局限性

PDA 具有自身的局限性，其無血管、淋巴、纖維組織、免疫細(xì)胞等間質(zhì)成分，腫瘤派生的類器官在體外可存活9～12 個月，離開培養(yǎng)液則不能生存[15]。各個實驗室三維類器官基膜培養(yǎng)所使用的試劑不同，最好的培養(yǎng)方法有待認(rèn)定。因此，從基因和細(xì)胞角度考慮腫瘤的復(fù)雜性，以及腫瘤實質(zhì)和鄰近間質(zhì)固有的非均質(zhì)性，腫瘤仿真實驗是一項艱巨的任務(wù)。

8 展 望

目前，三維類器官模型的實驗平臺尚處于“嬰兒期”，其可促進(jìn)藥物或化學(xué)品的系統(tǒng)性、重復(fù)性和定量研究。在發(fā)展類器官模型時，首要目標(biāo)是通過復(fù)雜的培養(yǎng)系統(tǒng)再現(xiàn)人體生理相關(guān)功能。三維生物打印的類器官模型提供了令人振奮的前景，其支持可復(fù)制的、自動化的復(fù)雜活體組織生產(chǎn)。類器官因其固有的空間和化學(xué)復(fù)雜性可能用于篩選新化合物或預(yù)測毒性。器官可能被重新創(chuàng)建，其與原生組織的相似性使其可優(yōu)先應(yīng)用于毒性測試、疾病或腫瘤模型[33]。此外，有望從PDA 的分子病理基因分型[34]和基因分子亞組分型[35]的角度，進(jìn)一步探索PDA 產(chǎn)生耐藥的分子病理學(xué)機(jī)制。同時也期待著融合瘤類器官的建立，融合瘤類器官是指融合正常組織來源與血管和神經(jīng)相連的腫瘤類器官。不同于僅僅關(guān)注單個腫瘤器官的細(xì)胞-細(xì)胞關(guān)系，多個腫瘤類器官將為器官-器官相互作用提供一種見解，這有助于對腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑進(jìn)行建模[36]。幸運的是，上述兩種設(shè)想方法涉及的細(xì)胞負(fù)載纖維和三維網(wǎng)格可能有助于克服類器官的血管化問題[37]。隨著培養(yǎng)方法的改進(jìn)，對類器官內(nèi)部成分的進(jìn)一步分析以及與其他技術(shù)的結(jié)合，相信類器官將推進(jìn)和拓寬人們對腫瘤學(xué)的理解，未來可作為臨床常規(guī)診斷治療的一部分，伴隨疾病的診療全程，為研究PDA 微環(huán)境相互作用、識別新的生物標(biāo)志物和促進(jìn)藥物敏感性研究提供了一個實用的工具，從而達(dá)到胰腺癌個體化和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突