microRNA在脊髓損傷修復(fù)機制中的研究進展

杜文君 張弢

1天津市人民醫(yī)院脊柱中心 300121；2天津醫(yī)院骨科 300211

0 引 言

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）在臨床上十分常見，每年大約導(dǎo)致180 000 例患者發(fā)生永久性軀體功能障礙[1-3]。最初的損傷往往可引發(fā)一系列復(fù)雜的繼發(fā)級聯(lián)病理生理反應(yīng)包括神經(jīng)系統(tǒng)本身、血管和免疫系統(tǒng)，這些繼發(fā)的病理生理改變在很大程度上決定了脊髓損傷患者的預(yù)后[4]。目前，對于SCI 治療的重點是控制繼發(fā)損傷并促進神經(jīng)再生[5]。然而，當前SCI 的治療效果并不理想，其主要原因為對SCI 損傷的病生理分子機制并未完全清楚[6-8]。因此，SCI 相關(guān)分子機制理論研究進展是提高SCI 患者治療效果的重要基礎(chǔ)[9-11]。

近年來，有研究者提出，繼發(fā)損傷和級聯(lián)反應(yīng)過程在很大程度上受微小RNA（microRNA，miRNA）的調(diào)控。miRNA 是一類大小約為22 nt 的非編碼RNA，被認為參與包括生長發(fā)育、腫瘤、損傷修復(fù)等多種人體病理生理過程。近年來，關(guān)于miRNA 與SCI 的研究較多，并證實miRNA 在多方面影響SCI 的病理生理過程及預(yù)后，包括細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)瘢痕形成及神經(jīng)再生等（圖1）。本文對microRNA在脊髓損傷修復(fù)機制中的研究進展進行簡要綜述。

圖1 脊髓損傷修復(fù)機制及其涉及的microRNA

1 microRNA 的產(chǎn)生及生物學(xué)功能

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 具有參與人體中代謝、凋亡及損傷修復(fù)等多種分子功能[12-13]。miRNA 始于pri-microRNA（PrimarymicroRNA）轉(zhuǎn)錄本（step 1）；這個70-100 nt 的發(fā)卡RNAs（pri-microRNA）經(jīng)Drosha加工為pre-microRNA（Precursor microRNA）（step 2）；pre-microRNA 被送出細胞核（step 3），進而被Dicer酶消化為21-25 nt 的microRNA（step 4）[14]；這個階段的miRNA 可結(jié)合RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）并與靶標mRNA 互補并列（step5-6）[15]；miRNA 和靶序列的互補程度決定了靶基因mRNA 或在翻譯水平被部分抑制或者完全斷裂（step 7）。近有報道表明，miRNA 也作用于5′-UTR 區(qū), 需要指出的是miRNA與3′-UTR 和5′-UTR 的結(jié)合是不完全互補的，但具體的機制仍不明確。

2 脊髓損傷后差異表達基因及潛在功能

越來越多的證據(jù)表明，miRNA 在脊髓中表達水平普遍較高，脊髓損傷（SCI）大鼠模型中，miRNA 表達譜系發(fā)生明顯改變，其中約有60 個以上的miRNA呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達[16]。在另一項研究中，包括miRNA-124、miRNA-129 和miRNA-1 在內(nèi)的32 種miRNA 顯著下調(diào)，但miRNA-21 在挫傷大鼠脊髓的損傷部位顯著上調(diào)[17]。有趣的是，在小鼠SCI 模型中，miRNA-223 的表達一直維持上調(diào)至SCI 后3 d。然而，從損傷后第1 天到第7 天，miRNA-124a 的表達明顯下降[18]。因此認為，miRNA 表達譜系改變（包括上調(diào)或下調(diào)表達）在SCI 的大鼠或小鼠模型中是普遍存儲。生物信息學(xué)分析表明，SCI 后差異表達的miRNA 的潛在靶點包括參與SCI 發(fā)病機制的基因，如炎癥、氧化應(yīng)激、細胞凋亡和神經(jīng)再生等。因此，這些脊髓損傷后差異表達的基因，可能是作為SCI 損傷診斷、預(yù)后、分子機制及治療的潛在重要靶點。SCI后差異表達的miRNA 中，miRNA-21 和miRNA-146a已被證明可通過減少細胞凋亡和星形膠質(zhì)細胞對損傷的反應(yīng)來促進神經(jīng)功能修復(fù)，是SCI 后的保護因子[19-21]。然而miRNA-181a、miRNA-411、miRNA-99a、miRNA-133b 和miRNA-15b 可增強損傷的炎癥反應(yīng)，是SCI 后的損傷因子[22]。此外，其他一些研究表明，miRNA 還可調(diào)節(jié)SCI 后的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，并通過靶向抗氧化酶防御系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）來調(diào)節(jié)再髓鞘化。因此，miRNA 已被認為是SCI 病理過程的生物標志物以及治療靶點。脊髓損傷后差異表達miRNA 及功能見表1。

表1 脊髓損傷后差異表達miRNA 靶基因及功能

3 MicroRNA 與脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞類型，占膠質(zhì)細胞總數(shù)的50%以上[23]。脊髓損傷后，星形膠質(zhì)細胞可通過增殖（星形細胞增多）和肥大（星形膠質(zhì)細胞增生）而被激活。大量研究表明，星形膠質(zhì)增生可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和星形膠質(zhì)細胞增生影響瘢痕組織形成[24-25]。星形膠質(zhì)增生、髓鞘碎片和瘢痕組織在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生失敗的過程中起著重要作用，這可能是創(chuàng)傷修復(fù)所必需的，但也能抑制軸突再生[25-26]。因此，通過調(diào)節(jié)損傷部位周圍星形膠質(zhì)細胞的增殖和肥大程度來控制膠質(zhì)瘢痕的形成是一種潛在的治療方法。

靶向星形膠質(zhì)細胞增生也有可能促進脊髓損傷后軸突再生，這一點已被一些研究結(jié)果所證實。例如，阻斷脊髓損傷后的反應(yīng)性膠質(zhì)增生，可在一定程度上促進功能恢復(fù)，促進軸突再生。星形膠質(zhì)增生抑制也可導(dǎo)致病變部位軸突密度增加。最近的一項研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細胞瘢痕的形成有助于而不是阻止中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的再生[27]。

星形膠質(zhì)細胞增生是由一些眾所周知的途徑調(diào)節(jié)的，如cAMP、STAT3、NF-κB、Rho 激酶、JNK 和mTOR[28]。如星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性依賴于RhoA 信號通路的活性，并且可通過靶向RhoA 來降低星形細胞的反應(yīng)性[29]。據(jù)報道，由于膠質(zhì)瘢痕的形成，可致星形膠質(zhì)細胞活性增強[30]。另外，PTEN 基因可能通過P13K/Akt/mTOR 信號通路在體內(nèi)反應(yīng)性星形膠質(zhì)增生的早期起作用[31]。同時，JAGG-1 可通過調(diào)節(jié)NF-κB 和JAK/STAT/SOCS3 信號通路來調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的激活途徑[32-34]。近年來，新的證據(jù)表明miRNA 參與了星形膠質(zhì)細胞增生的主要信號通路。如miRNA-582 和miRNA-590 靶向NF-κB 信號通路；miRNA-146a、miRNA-133b 和miRNA-124 可 直接調(diào)節(jié)RhoA 信號通路[35]。雖然缺乏直接證據(jù)，但以上發(fā)現(xiàn)表明這些miRNA 可能通過調(diào)節(jié)這些重要途徑參與脊髓損傷的過程或恢復(fù)。

4 microRNA 與脊髓損傷后細胞凋亡

細胞凋亡或程序性細胞死亡是脊髓損傷的一個標志。已有研究證實，眾多miRAN 參與了脊髓損傷后的細胞凋亡過程。在參與這一過程的miRNA中，miRNA-21 被證明是脊髓損傷后重要的差異表達miRNA 之一[36]。miRNA-21 是Fas 配體基因FASLG和PTEN 的抑制因子，兩者均促進細胞凋亡[37-38]；而上調(diào)miRNA-21 表達后，能夠明顯抑制FASLG 和PTEN的表達從而抑制凋亡[39-41]。Strickland 等[17]證明，脊髓損傷后4 d miRNA-21 表達顯著上調(diào)，但到第14 天才相對下調(diào)。這種效應(yīng)解釋了損傷后4～10 d 從肥大到增生的轉(zhuǎn)變。盡管下調(diào)miRNA-21 似乎對星形膠質(zhì)細胞增生具有抑制作用，但對神經(jīng)元細胞死亡卻具有促進作用。與miRNA-21 相似，miRNA-146a 具有抗凋亡和抗炎作用。除miRNA-21 和miRNA-146a外，miRNA-9 可通過直接調(diào)節(jié)單核細胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1 基因（MCPIP1）來控制細胞凋亡，MCPIP1是已知的促凋亡和巨噬細胞激活基因[42-43]。在脊髓損傷后1～7 d，miRNA-9 在腹角運動神經(jīng)元中顯著下調(diào)，而MCPIP1 在損傷部位上調(diào)，這一假設(shè)已得到證實[44]。然而，到第7 天，miRNA-9 表達增加，從而抑制MCPIP1 的表達。同時，MCPIP1 還促進膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達，在星形膠質(zhì)細胞增生期間可見反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞表達[45]。因此，miRNA-9 似乎對脊髓損傷具有雙峰效應(yīng)，因此在急性期下調(diào)miRNA-9 可使GFAP 表達和星形膠質(zhì)細胞活化，而miRNA-9 在第7 天上調(diào)則表明腹側(cè)運動角細胞具有神經(jīng)保護作用?？紤]miRNA-21 在急性脊髓損傷中具有很強的抗凋亡作用，miRNA-9 可能與miRNA-21 相反，因此一個miRNA-21 的下調(diào)可被另一個的上調(diào)所抵消。為闡明miRNA-9 與miRNA-21之間的關(guān)系，還需進一步的研究來觀察miRNA-9 和miRNA-21 在7 d 后的表達。

一般情況下，脊髓損傷后的細胞凋亡是由靶向促凋亡基因（如Caspase 家族基因）的miRNA 下調(diào)，或靶向抗凋亡基因（如BCL2 或MYC）的miRNA 上調(diào)引起的[37,46-55]。這些調(diào)節(jié)作用為潛在的治療策略提供了多種途徑，包括調(diào)節(jié)促凋亡和抗凋亡miRNA 的平衡。研究表明，casp21-15b 和casp21-15b 是調(diào)節(jié)凋亡的重要因子。已有研究認為，脊髓損傷后可通過miRNA-21 對v-akt 小鼠胸腺瘤病毒同源癌基因1同源基因AKT1 和磷脂酰肌醇三磷酸的影響來達到抗凋亡作用[56]。另一種潛在的治療策略是創(chuàng)傷后低溫和反義沉默。Truettner 等[57]研究證明，特定的miRNA 對腦損傷中的創(chuàng)傷后低溫敏感，結(jié)果會降低其凋亡效應(yīng)。

5 microRNA 脊髓損傷后炎癥反應(yīng)

在脊髓損傷的情況下，炎癥往往會造成組織進一步的損傷和細胞過度死亡。星形膠質(zhì)細胞增生的主要功能之一是減少病變部位內(nèi)及周圍的炎癥反應(yīng)，以減少繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷起始點以外的擴散。在脊髓損傷中，幫助調(diào)節(jié)機體炎癥過程的各種miRNA 的表達發(fā)生改變，是潛在治療的重要靶點。miRNA-146a 與miRNA-21 密切相關(guān)，可參與星形膠質(zhì)細胞肥大向增生的轉(zhuǎn)變。研究表明，脊髓損傷時miRNA-146a 在脊髓星形膠質(zhì)細胞中高表達。其靶點是促炎酶環(huán)氧化酶2（COX-2）和由基因IL1B 和IL6編碼的蛋白質(zhì)[58-59]。此外，研究還表明miRNA-146a在巨噬細胞中通過白細胞介素1 受體相關(guān)激酶1基因（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 基因（TRAF6）與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 進行循環(huán)反饋[58]。巨噬細胞中NF-κB 途徑的激活上調(diào)miRNA-146a，導(dǎo)致IRAK1 和TRAF6 途徑成分的下調(diào)[60]。然而，盡管一些關(guān)于增生性膠質(zhì)瘢痕的研究將功能缺陷歸因于miRNA-146a 的過度表達，但有其他研究認為miRNA-146a 在預(yù)防炎癥的有害影響方面具有重要價值[61-62]。因此，盡管miRNA-146a 在急性抗炎治療方案中是有益的，但miRNA-146a 在脊髓損傷亞急性期的過度表達似乎變得有害。Notch-1 基因可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞惡性增殖，但miRNA-146 對其有抑制作用。另一個miRNA，即miRNA-223 在中性粒細胞聚集增加的區(qū)域過度表達，這表明miRNA-223 與中性粒細胞歸巢有關(guān)。這一過程與肥大的星形膠質(zhì)細胞相反，后者試圖在星形膠質(zhì)細胞增生的亞急性期清除炎癥細胞的中央發(fā)生病變[63]。miRNA-223 的表達具有時間依賴性。脊髓損傷后12 h 和3 d 出現(xiàn)兩次高峰，之后明顯降低。這與脊髓損傷后1 d 中性粒細胞表達高峰相一致，隨后在脊髓損傷后5 d 出現(xiàn)下調(diào)。上述研究均表明，眾多miRNA 在脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

6 microRNA 與脊髓損傷后神經(jīng)再生

脊髓損傷后，神經(jīng)元損傷為不可逆。然而，miRNA為實現(xiàn)神經(jīng)元再生修復(fù)提供了一條途徑。Liu 等[64]進行的研究認為，當脊髓發(fā)生損傷后，機體試圖通過miRNA 的作用，通過表達少數(shù)基因來保護神經(jīng)元并刺激神經(jīng)元的生長、再生和再髓鞘化。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因（BDNF）和細胞分裂周期42 基因（CDC42）等都是積極影響脊髓損傷自我修復(fù)的基因。這些基因的表達與被認為是靶向它們的大量miRNA 成反比（BDNF 可受miRNA-183、miRNA-195、miRNA-30a、miRNA-182、miRNA-381、miRNA-300-3p和miRNA-325-5p 的影響）；而CDC42 受miRNA-185、miRNA-329、miRNA-340-5p、miRNA-381 和miRNA-383的影響。此外，一些miRNA 被認為促進了這兩個基因，這兩組miRNA 之間的平衡可能在自我修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。

在脊髓損傷中，miRNA-124 在損傷部位及其周圍的前7 d 持續(xù)下調(diào)[65]。其他研究表明，miRNA-124通過下調(diào)巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞的表達來減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，同時維持星形膠質(zhì)細胞的表達，從而維持星形膠質(zhì)瘢痕的抗炎作用[66]。因此，眾多miRNA的生物學(xué)功能可能于脊髓損傷后神經(jīng)再生有關(guān)，并有望成為脊髓損傷后治療的潛在靶點并為研發(fā)藥物提供依據(jù)。

7 展 望

脊髓損傷修復(fù)機制復(fù)雜，多種因子及損傷修復(fù)機制參與其中，包括炎癥、細胞凋亡、ROS 形成和星形膠質(zhì)細胞增生等。近年來，眾多研究已經(jīng)證實miRNA在脊髓損傷和修復(fù)中的重要作用及其可能的分子機制。不同miRAN 在脊髓損傷中的作用是不同的，有些miRNA 可能起到抑制損傷、促進修復(fù)的作用，同時也有一些miRNA 則起到相反的作用。篩選并鑒別這些在脊髓損傷后差異表達及差異功能的miRNA 有望成為促進脊髓損傷康復(fù)及治療的靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突