不同培養(yǎng)基上羊肚菌菌株產(chǎn)無(wú)性孢子觀察

祁 鵬 張黎光 戴 璐 路鵬鵬 劉 愚 喬 婷 陳世明 李峻志*

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2陜西寧陜縣秦南菌業(yè)科技有限公司，陜西安康 711699）

羊肚菌隸屬子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科，是一類世界性分布食藥兼用的珍稀菌類[1-4]。文獻(xiàn)記載，1990 年，VOLK、LEONARD[5]描述了羊肚菌無(wú)性孢子，并指出羊肚菌可能經(jīng)歷兩種不同的生活史途徑。2007 年，PILZ[6]報(bào)道并描繪了羊肚菌的無(wú)性孢子的形態(tài)，但缺乏更加詳盡的影像資料。直到2010 年，MASAPHY 通過(guò)電子掃描顯微鏡觀察并首次報(bào)道了紅褐羊肚菌（Morchella rufobrunnea）的無(wú)性孢子[7]。但迄今為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于羊肚菌無(wú)性孢子的相關(guān)研究仍然較少。

筆者所在團(tuán)隊(duì)自1999年起開(kāi)始研究羊肚菌，多年來(lái)積累了一定的羊肚菌種質(zhì)資源和技術(shù)成果[8-12]。羊肚菌人工栽培及其他試驗(yàn)過(guò)程中均出現(xiàn)無(wú)性孢子的現(xiàn)象（即“菌霜”），但國(guó)內(nèi)針對(duì)羊肚菌無(wú)性孢子的研究和微觀描述目前較少，且是否所有羊肚菌均能夠產(chǎn)生無(wú)性孢子尚不清楚。為此，筆者隨機(jī)觀察記錄了5 株不同來(lái)源的羊肚菌菌株在3 種培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢情況及孢子的微觀特征，期望有助于我國(guó)羊肚菌的人工栽培技術(shù)研究和商業(yè)化開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

羊肚菌菌株隨機(jī)選自陜西省微生物研究所秦嶺菌物標(biāo)本館（SXIM），分離純化后，編號(hào)M1、M2、M3、M4、M5保藏。

表1 供試羊肚菌菌株及來(lái)源

1.2 供試培養(yǎng)基

根據(jù)羊肚菌的生態(tài)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)3種培養(yǎng)基，分別編號(hào)為①、②、③。①PDA 培養(yǎng)基。②木屑培養(yǎng)基：細(xì)木屑90%，麩皮9%，硫酸鎂1%。培養(yǎng)料含水量55%～60%，pH 自然。拌料后裝入培養(yǎng)皿中，厚度8～10 mm，121 ℃滅菌20 min。③腐殖土培養(yǎng)基：將腐殖土篩去石頭和樹(shù)枝后，按照1∶1 質(zhì)量比加入細(xì)沙土，培養(yǎng)料含水量40%～50%，pH 自然。拌料后裝入培養(yǎng)皿中，厚度8～10 mm，121 ℃滅菌120 min。

1.3 供試菌株的培養(yǎng)

將M1、M2、M3、M4、M5 菌株的純培養(yǎng)物分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中20 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，待菌絲即將長(zhǎng)滿平板時(shí)，取出備用。

1.4 供試羊肚菌菌株在3 種培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)及無(wú)性孢子觀察

用打孔器在M1、M2、M3、M4、M5 菌株的固體培養(yǎng)基平板上的菌落邊緣區(qū)域，均勻打取直徑6 mm的菌絲體塊，分別接種于供試培養(yǎng)基①、②、③上，并在每個(gè)接種后的平板插入無(wú)菌的蓋玻片，25 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d 后[13]，采用奧林巴斯BX43 生物顯微鏡觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試羊肚菌菌株在3種培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)狀況

供試羊肚菌菌株在3種培養(yǎng)基上菌絲都能夠很好的生長(zhǎng)，但只有M2、M4菌株在培養(yǎng)基③上產(chǎn)生無(wú)性孢子。

表2 供試羊肚菌菌株在3種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)狀況

2.2 供試羊肚菌菌株在3 種培養(yǎng)基上產(chǎn)無(wú)性孢子觀察結(jié)果

供試羊肚菌菌株在3 種培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～8 d，在培養(yǎng)基③上，M2、M4 菌株率先產(chǎn)生無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生無(wú)性孢子，其余菌株及培養(yǎng)基上，即使培養(yǎng)30 d仍未產(chǎn)生無(wú)性孢子。

由此可見(jiàn)，3 種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基①和培養(yǎng)基②不適合作為羊肚菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基③可作為羊肚菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

就5 株供試羊肚菌菌株而言，M2、M4 菌株在培養(yǎng)基③上都產(chǎn)生了無(wú)性孢子，而在培養(yǎng)基①和②上均未產(chǎn)生無(wú)性孢子；M1、M3、M5 菌株在3 種培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生無(wú)性孢子，因此推測(cè)這3 株羊肚菌繁殖不存在無(wú)性孢子階段，與M2、M4菌株的生長(zhǎng)發(fā)育階段差異較大。

2.3 供試M2、M4菌株無(wú)性孢子的顯微結(jié)構(gòu)

在顯微鏡下觀察M2 與M4 羊肚菌菌株無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)存在明顯差異。2 株羊肚菌菌株均在氣生菌絲的頂端產(chǎn)生無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)均具備明顯分化的孢子梗，一、二級(jí)分枝，分支末端即為小梗，小梗以輪狀著生于分支菌絲上，每輪有3～6個(gè)小梗，在每個(gè)孢子梗的頂端以出芽方式產(chǎn)生1～2 個(gè)無(wú)性孢子。小梗長(zhǎng)度為8～12 μm，無(wú)性孢子直徑3～5 μm。無(wú)性孢子圓球形至橢圓球形，光滑，無(wú)色透明，單核，有油滴（圖1）。

圖1 M2、M4羊肚菌菌株無(wú)性孢子梗及無(wú)性孢子

3 小結(jié)與討論

羊肚菌在石灰?guī)r、白堊質(zhì)土壤、腐殖土、黑黃色壤土、沙泥混合土、沙壤土中均能夠生長(zhǎng)。供試5株羊肚菌菌株在3種培養(yǎng)基上都能夠很好地進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，也驗(yàn)證了羊肚菌菌絲具備較強(qiáng)生長(zhǎng)能力，能夠從多種不同的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中獲取營(yíng)養(yǎng)，這可能是其在全世界范圍內(nèi)分布較廣泛的重要原因。

供試菌株M2（尖頂羊肚菌）和M4（梯棱羊肚菌）在培養(yǎng)基③上產(chǎn)生了無(wú)性孢子，這一共同發(fā)育階段，表明這兩個(gè)種在進(jìn)化過(guò)程中具備更近的親緣關(guān)系，該特征或許可作為部分種屬羊肚菌分類和鑒定的微觀依據(jù)。供試粗腿羊肚菌菌株未見(jiàn)到無(wú)性孢子階段，但不影響其在野外的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，可能其不存在無(wú)性孢子的生長(zhǎng)發(fā)育階段。目前對(duì)尖頂羊肚菌等無(wú)性孢子產(chǎn)生的作用、機(jī)理以及與羊肚菌子囊果發(fā)生的關(guān)系尚不明確。針對(duì)羊肚菌生活史和系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程，筆者將會(huì)繼續(xù)進(jìn)行研究探索，并期望通過(guò)研究為羊肚菌人工馴化及穩(wěn)產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。