黑木耳醇提物清除自由基能力及對(duì)α-淀粉酶抑制效果研究

劉天一 李明玉 邵志悅 季啟天 王 萍，2*

（1東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2黑龍江省森食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040）

黑木耳（Auricularia auricula）又稱木耳、桑耳、云耳等，屬擔(dān)子菌亞門，擔(dān)子菌綱，木耳科，木耳目，木耳屬[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，木耳子實(shí)體中含有多種活性物質(zhì)，包括黑木耳多糖、黑色素、膠原蛋白、多酚和黃酮類化合物以及鈣、鐵、鋅、錳等微量元素[2]，具有抗氧化[3]、降血脂[4-5]、降血糖[6]、抑菌[7]、抗凝血[8-9]、抗腫瘤[10-11]、抗輻射[12]等功效，為營養(yǎng)豐富的藥食同源食用菌，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值及醫(yī)藥價(jià)值。

自由基是生物體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，具有一定功能。但研究表明，過量的自由基會(huì)干擾、破壞人體內(nèi)的正常代謝，破壞正常細(xì)胞和組織，造成蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子的損傷，引起糖尿病、高血壓、心血管疾病、老年癡呆、癌癥等多種疾病[13-15]。常見的自由基有DPPH·、OH·、ABTS+·、O2-，其中，DPPH·、ABTS+·因其性質(zhì)穩(wěn)定，試驗(yàn)操作方便，成為評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物自由基清除能力的常用方法。糖尿病作為慢性非傳染性代謝疾病，在現(xiàn)代社會(huì)中已經(jīng)成為威脅到人類生命健康的關(guān)鍵因素，其主要特征表現(xiàn)為高血糖，因此控制住人體血糖水平是有效減緩糖尿病的重要措施[16]。α-淀粉酶能夠水解淀粉，促進(jìn)其消化，從而導(dǎo)致人體餐后血糖水平升高，因此抑制α-淀粉酶就能夠有效阻止淀粉水解，從而控制糖尿病的發(fā)展[17]。

現(xiàn)階段多是以某一具體成分對(duì)于黑木耳進(jìn)行功能性評(píng)價(jià)，對(duì)于粗提物進(jìn)行評(píng)價(jià)的很少，并且降血糖功能評(píng)價(jià)多以動(dòng)物試驗(yàn)為主，國內(nèi)對(duì)酶法抑制研究降血糖報(bào)道較少。因此筆者通過不同黑木耳醇提物對(duì)α-淀粉酶的活性抑制進(jìn)行體外降血糖功能評(píng)價(jià)，同時(shí)進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，為黑木耳相關(guān)食品的開發(fā)利用提供研究數(shù)據(jù)以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

黑木耳，購自大興安嶺；α-淀粉酶、DPPH、ABTS 購自上海源葉科技有限公司，無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、可溶性淀粉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海精密儀器有限公司；TU-1810 型PC722s 分光光度計(jì)，上海精密儀器有限公司；DK-S12 電熱恒溫水浴鍋，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；EPOCH12 酶標(biāo)分析儀，BioTek Instruments，Inc。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳粉的制備

將干黑木耳與水以體積比1∶25 的比例泡發(fā)2 h，將泡發(fā)后的黑木耳瀝干再放置于托盤中，放于37 ℃烘箱中烘干8 h，將烘干后的黑木耳放入粉碎機(jī)粉碎，收集顆粒為0.178～0.420 mm的黑木耳粉。

1.3.2 醇提物的制備

將黑木耳粉分別與5組不同體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）的乙醇以料液比1∶60 置于40 ℃恒溫水浴鍋中3 h，將粗提物進(jìn)行過濾并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至相同體積得到提取液，之后置于37 ℃烘箱中烘干至恒重，用保鮮膜密封凍存。

1.3.3 對(duì)DPPH·清除率測定

參照SUN 等[18]方法略作修改。精確吸取0.5 mL提取液、2.5 mL 0.1 mM DPPH-乙醇溶液并均勻混合，避光反應(yīng)30 min，用去離子水作為參比；對(duì)照組采用2.5 mL 無水乙醇代替DPPH 工作液；空白組采用0.5 mL 無水乙醇代替樣品溶液，于517 nm 波長處測定吸光值，計(jì)算清除率。

式中，A1為樣品組吸光值，A2為對(duì)照組吸光值，A3為空白組吸光值。

1.3.4 對(duì)ABTS+·清除率測定

參照GARZóN 等[19]方法略作修改。準(zhǔn)確吸取0.2 mL 提取液、4.0 mL ABTS 工作液（2.6 mmol/L K2S2O8溶液與7.4 mmol/L ABTS 溶液等體積均勻混合，避光反應(yīng)12 h，用pH7.4 的PBS 溶液稀釋40～50倍，令其在734 nm波長處吸光值為（0.7±0.02）。二者震蕩充分混勻，靜置6 min，于734 nm 波長處測定吸光值；空白組采用蒸餾水代替提取液，計(jì)算清除率。

式中，A0為空白組吸光值，A為樣品組吸光值。

1.3.5 抑制α-淀粉酶活性測定

參照HARA 等[20]方法略作修改。準(zhǔn)確吸取50 μL 提取液、50 μL α-淀粉酶溶液（6 U/mL）于試管中混合均勻。在30 ℃下孵育10 min 后，加入800 μL 0.5%的可溶性淀粉（含pH6.8 0.1 mol/L PBS緩沖液）。繼續(xù)在30 ℃下孵育20 min 后，加入125 μL 2 mol/L NaOH 溶液和125 μL DNS 試劑終止反應(yīng)。在99 ℃沸水浴下加熱10 min 后迅速冷卻至室溫，在540 nm波長處測定吸光值，計(jì)算抑制率。

式中，A3為加入樣品溶液和加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A4為加入樣品溶液和不加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A1為不加入樣品溶液和加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A2為不加入樣品溶液和不加入α-淀粉酶溶液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)平行測定三次，結(jié)果用X±SD 表示，采用SPSS 21 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、Origin 8.5 進(jìn)行作圖，以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳乙醇提取物對(duì)DPPH·清除能力

DPPH·清除能力結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇黑木耳提取物對(duì)DPPH·清除能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，DPPH·被清除。由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，乙醇提取物對(duì)DPPH·清除率整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，各組清除率存在顯著性差異。體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取物的清除率達(dá)到最大值，為（44.74±0.74）%，明顯較其他體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物清除能力高。汪璐等[21]研究表明，隨著黑木耳醇提物濃度的升高，對(duì)DPPH·清除率呈上升趨勢，1.6 mg/mL 95%乙醇體積分?jǐn)?shù)的黑木耳醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除率為40.43%，試驗(yàn)較其他效果略好。結(jié)果表明，黑木耳醇提物具有清除DPPH·的功能，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的黑木耳提取物效果不同，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取物的清除率達(dá)到最大值，推測隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，提取溶劑極性逐漸減小，活性成分含量呈先增后減趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)醇提物濃度最高，從而對(duì)DPPH·清除效果最好。

2.2 ABTS+·清除能力

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)ABTS+·的清除

ABTS+·清除能力如圖2 所示。ABTS 被氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色自由基陽離子ABTS+·，當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，ABTS+·與其反應(yīng)被清除。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，ABTS+·的清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。體積分?jǐn)?shù)60%乙醇醇提物清除率達(dá)到最大值，為（68.38±1.34）%，根據(jù)顯著性分析各組黑木耳醇提物對(duì)ABTS+·清除率差異不顯著。由于使用的粗提物未進(jìn)行純化，因此結(jié)果與翟雅琴[22]研究結(jié)果存在一定差異。但結(jié)果表明，黑木耳醇提物具有清除ABTS+·的功能，可抑制其在機(jī)體內(nèi)引發(fā)的過氧化反應(yīng)，有效維持體內(nèi)自由基平衡。

2.3 黑木耳乙醇提取物對(duì)α-淀粉酶活性抑制

α-淀粉酶是糖代謝過程中的一種酶，能夠促進(jìn)淀粉消化，引起血糖升高。抑制α-淀粉酶活性，可阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，從而控制血糖的升高，達(dá)到降血糖的目的。如圖3所示，隨著樣品濃度的升高，黑木耳醇提物對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢。在5 組乙醇體積分?jǐn)?shù)提取條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)60% 的醇提物IC50最大，為127.819 mg/mL；而乙醇體積分?jǐn)?shù)30%的醇提物IC50最小，為49.57 mg/mL，對(duì)α-淀粉酶的活性抑制效果最好，因此具有更高效的降血糖功效。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇提取物對(duì)α-淀粉酶的活性抑制

3 小結(jié)

對(duì)黑木耳醇提物的自由基清除能力和α-淀粉酶的抑制進(jìn)行了體外研究評(píng)價(jià)，結(jié)果表明在料液比1∶60、水浴溫度40 ℃、浸提時(shí)間3 h 的條件下，對(duì)DPPH·的清除、ABTS+·的清除、α-淀粉酶的活性抑制效果最顯著時(shí)所對(duì)應(yīng)的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%和30%。黑木耳醇提物具有比較顯著的抗氧化和降血糖功效，其數(shù)據(jù)為開發(fā)黑木耳降血糖及抗氧化藥物和食品提供了理論依據(jù)。但黑木耳醇提物仍具有潛在的開發(fā)研究價(jià)值，目前關(guān)于純化后的黑木耳醇提物降血糖功效的研究甚少，體內(nèi)含有的活性物質(zhì)和功能的相關(guān)性也仍需要進(jìn)一步探究。