響應面法優(yōu)化羊肚菌液體發(fā)酵營養(yǎng)條件

趙航軻 陳 杭 馬 薇 羊玉蓉 降初拉爾布 唐 瑤 唐明先

（甘孜州農業(yè)科學研究所，四川康定 626000）

羊肚菌（Morchella）隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。羊肚菌富含多種氨基酸[4]，除色氨酸外，其余必需氨基酸含量均比面包、牛奶、牛肉等的含量高，還含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白質，具有很高的營養(yǎng)價值[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖和蛋白質[6]具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗氧化和降低膽固醇等生物活性[7]，對抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有重要意義。

隨著食用菌產業(yè)的發(fā)展，菌種的生產要求越來越高，而食用菌液體菌種具有制種周期短、成本低、易操作、純度高、菌齡一致等優(yōu)勢，在金針菇、黑木耳、杏鮑菇等食用菌生產中廣泛應用[8]。目前有關羊肚菌液體菌種研究較少。筆者在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 響應面法對羊肚菌液體發(fā)酵營養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期為羊肚菌液體菌種制備及菌絲深層發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試羊肚菌菌株：六妹羊肚菌（Morchellasextelata）。（2）基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO41 g，VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將保藏的羊肚菌菌種接種于平板培養(yǎng)基上，置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。

1.2.2 羊肚菌液體菌種培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

碳源篩選：取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，分別接種至用玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，其余組分與基礎培養(yǎng)基相同。250 mL 三角瓶，裝液量為150 mL，pH 自然，置24 ℃、130 r/min 恒溫搖床，培養(yǎng)7 d。菌絲體用蒸餾水清洗，置55 ℃干燥箱中烘至恒重，稱量菌絲體干重，確定最適碳源，并進一步篩選出其最適質量濃度。試驗設置5個平行。

氮源篩選：分別取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，接種至用硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、蛋白胨、黃豆粉、尿素、硝酸鈣替代酵母粉的液體培養(yǎng)基中，其他操作同碳源試驗。

無機鹽篩選：分別取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，接入用MnSO4、KH2PO4、FeSO4、CaCl2、NaCl、K2PO4、K2HPO4、K2SO4替代K2HPO4的液體培養(yǎng)基中，其他操作同碳源試驗。

生長因子篩選：分別取活化羊肚菌菌塊0.5 cm2，接入用VB2、VB6、VBH、吲哚乙酸、葉酸、煙酸、赤霉素替代VB1的基礎培養(yǎng)基中，其他操作同碳源試驗。

液體培養(yǎng)營養(yǎng)條件響應面法優(yōu)化：如表1所示，在上述單因素試驗基礎上，分別選取碳源（X1）、氮源（X2）、無機鹽（X3）、生長因子（X4）4 個因素為考察對象，以菌絲體干重（Y1）為響應值，采用響應面分析法確定羊肚菌液體培養(yǎng)最佳營養(yǎng)條件。

表1 羊肚菌液體培養(yǎng)基4因素3水平試驗設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

（1）碳源：由圖1a、b 可知，8 種供試碳源中以玉米粉為唯一碳源時，羊肚菌菌絲體干重最高（P＜0.05），為4.77 g/L，所以確定玉米粉為試驗最適碳源，最適質量濃度為20 g/L。

（2）氮源：由圖2a、b 可知，8 種供試氮源中以黃豆粉為唯一氮源時，羊肚菌菌絲體干重最高（P＜0.05），為5.95 g/L，所以確定黃豆粉為試驗最適氮源，最適質量濃度為5 g/L。

（3）無機鹽：如圖3a、b 所示，8 種供試無機鹽中以KH2PO4為唯一無機鹽時，菌絲體干重最高（P＜0.05），為6.94 g/L，所以確定KH2PO4為最適無機鹽，最適質量濃度為1.5 g/L。

（4）生長因子：如圖4a、b 所示，7 種供試生長因子中以VB6為唯一生長因子時，菌絲體干重最高（P＜0.05），為8.65 g/L，所以確定VB6為最適生長因子，最適質量濃度為10 mg/L。

圖1 供試碳源（a）及最適碳源質量濃度梯度篩選結果（b）

圖2 供試氮源（a）及最適氮源質量濃度梯度篩選結果（b）

圖3 供試無機鹽（a）及最適無機鹽質量濃度梯度篩選結果（b）

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

試驗結果見表2。

圖4 供試生長因子（a）及最適生長因子質量濃度梯度篩選結果（b）

以X1、X2、X3和X4為響應變量，以Y1值為響應值對表2 數(shù)據進行處理，方差分析（表3），模型P值＜0.001，因此該模型有意義且達到最顯著水平。X1、X2、X3、X4、X1X2、X12、X22、X32、X42項差異極顯著，X1X3、X2X3差異顯著，X1X4、X2X4、X3X4差異不顯著。復相關系數(shù)R2＝0.9674，表明相關性好，失擬值P值0.1348＞0.05，實驗可信。經Design-Expert 8.0.6軟件分析得到預測模型為：

Y1=+11.25+0.53X1+0.62X2+0.25X3+0.70X4-0.46X1X2-0.37X1X3-0.081X1X4+0.31X2X3+0.17X2X4-0.27X3X4-0.93X12-0.95X22-0.93X32-0.99X42

利用回歸方程分析羊肚菌菌絲體干重隨各因素變化的響應曲面圖。由響應曲面圖可知玉米粉、黃豆粉、KH2PO4、VB6各因素對菌絲體干重的影響。每個響應面代表2 個獨立因素之間的交互作用，另一個因素保持在0水平編碼。

玉米粉質量濃度與黃豆粉質量濃度兩因素的交互作用極顯著：在玉米粉質量濃度較高時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩(wěn)，隨后略有下降；在黃豆粉質量濃度較高時，隨著玉米粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩(wěn)，隨后略有下降；在玉米粉質量濃度較低時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后穩(wěn)步下降；在黃豆粉質量濃度較低時，隨著玉米粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后穩(wěn)步下降（圖5）。

表2 響應面試驗設計因素水平及結果

表3 響應面試驗方差分析

圖5 玉米粉質量濃度與黃豆粉質量濃度兩因素的交互作用

黃豆粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用顯著：在KH2PO4質量濃度較高時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩(wěn)，隨后下降；在KH2PO4質量濃度較低時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后下降；在黃豆粉質量濃度較高時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升，隨后略有下降；在黃豆粉質量濃度較低時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后穩(wěn)步下降（圖6）。

玉米粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用顯著：在KH2PO4質量濃度較高時，隨著玉米粉質量濃度的上升，菌絲體干重迅速上升至平穩(wěn)，隨后略有下降；在KH2PO4質量濃度較低時，隨著玉米粉質量濃度的上升，菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后穩(wěn)步下降；在玉米粉質量濃度較高時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，菌絲體干重迅速上升至平穩(wěn)，隨后略有下降；在玉米粉質量濃度較低時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，菌絲體干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后穩(wěn)步下降（圖7）。

圖6 黃豆粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用

圖7 玉米粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，影響羊肚菌菌絲體干重的各因素最優(yōu)值為玉米粉20.33 g/L，黃豆粉5.34 g/L，KH2PO41.53 g/L，VB610.73 mg/L，此營養(yǎng)條件培養(yǎng)羊肚菌菌絲體干重（理論）達11.54 g/L。

驗證試驗：為檢驗培養(yǎng)基優(yōu)化工藝的可信度，結合實際試驗操作的可行性，采用最優(yōu)營養(yǎng)條件組合進行5 次驗證試驗，得羊肚菌菌絲體干重為（11.35±0.21）g/L，相對誤差為1.62%，該結果確定采用響應面法優(yōu)化羊肚菌液體培養(yǎng)最佳營養(yǎng)條件是有效可行的。

3 小結

羊肚菌液體發(fā)酵周期短，污染率低，生產成本低。季向陽等通過正交試驗確定羊肚菌最佳液體培養(yǎng)條件，優(yōu)化后菌絲體干重最高為9.18 g/L[9]。筆者采用單因素試驗結合響應面法對羊肚菌液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化獲得的羊肚菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲球均勻致密，驗證試驗得出菌絲體干重為11.35 g/L，與文獻報道相比提高了23.64%。研究結果為羊肚菌深層發(fā)酵、液體菌種制備及人工栽培提供數(shù)據積累和試驗參考。