QuEChERS-分散固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法快速測(cè)定地龍中黃曲霉毒素

許曉輝，李晨曦，吳福祥，張虹艷，潘秀麗，李 赟，王小喬

(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 蘭州 730050)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素[1]，其衍生物有20多種，最常見(jiàn)的有M1、B1、B2、G1等，其中B1毒性最大、致癌性最強(qiáng)[2]. 黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1羥基化的一種代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一類致癌物質(zhì). 黃曲霉毒素主要存在于中藥材、食品及動(dòng)物飼料等相關(guān)產(chǎn)品中[3]，比氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥等的毒性大，當(dāng)人體攝入量過(guò)大時(shí)，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)出血性壞死、急性肝炎、肝細(xì)胞脂肪性病變和膽管增生等. 當(dāng)人體微量攝入時(shí)，可造成慢性中毒、生長(zhǎng)障礙和引起纖維性病變等[4]. 因黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的毒性和致癌性，許多國(guó)家和組織均規(guī)定了多種食品和中藥材中黃曲霉毒素的限量值，如2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定地龍藥材和飲片黃曲霉毒素B1不得超過(guò)5 μg/kg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得超過(guò)10 μg/kg[5].

目前，常見(jiàn)的測(cè)定黃曲霉毒素的方法主要有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和液質(zhì)聯(lián)用法等[6-8].前兩種方法雖然檢出限高，但在黃曲霉毒素濃度極低的樣品中，難以從微量復(fù)雜組分中靈敏檢出被檢測(cè)目標(biāo)化合物，而液質(zhì)聯(lián)用法能夠解決這一問(wèn)題. 如2020年版《中國(guó)藥典》就收載了液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定黃曲霉毒素的方法.四部通則中《2351 真菌毒素測(cè)定法黃曲霉毒素測(cè)定法》第一法中，試樣經(jīng)過(guò)70%甲醇水提取，提取液經(jīng)稀釋、離心后，使用高通量全自動(dòng)固相萃取儀，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉素特異抗體的免疫親和柱凈化和富集后，目標(biāo)化合物通過(guò)帶有三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定. 另一方面，黃曲霉毒素的法定限量值極低，基質(zhì)會(huì)影響其靈敏檢測(cè)，因此去除基質(zhì)干擾以增強(qiáng)復(fù)雜樣品微量組分中的分析物信號(hào)是其檢測(cè)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，而快捷有效去除基質(zhì)的前處理方法是實(shí)現(xiàn)這一目的有效途徑. 目前，檢測(cè)黃曲霉毒素時(shí)，最常見(jiàn)去除雜質(zhì)的凈化方法是使用免疫親和柱，但是這類凈化柱使用流程多、價(jià)格昂貴，不利于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室快速高效篩查黃曲霉毒素[9-10]. 近年來(lái)，在中藥材外源性風(fēng)險(xiǎn)因子檢測(cè)中，QuEChERS方法結(jié)合固相萃取柱或分散固相萃取管得到了廣泛應(yīng)用. 然而，在分析脂肪含量較高的樣品時(shí)，使用QuEChERS方法萃取并經(jīng)過(guò)C18或N-丙基乙二胺(PSA)凈化后，有可能出現(xiàn)不能有效去除脂質(zhì)的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致脂質(zhì)聚集于管路中，甚至堵住色譜柱，造成色譜柱柱壓升高、色譜圖異常、重復(fù)性差及精密度降低等情況. 而增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化材料(EMR-Lipid )是一種新型吸附劑，該產(chǎn)品結(jié)合了獨(dú)特的體積排阻和疏水相互作用，可選擇性去除樣品中的主要脂類[11]，且不會(huì)保留不需要的其他分析物，其適用于分散固相萃取(dSPE)步驟. 因而，EMR-Lipid dSPE和QuEChERS結(jié)合，提取凈化處理會(huì)變得快捷高效.

地龍，鋸蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓的干燥體，是我國(guó)重要的中藥材之一. 最早的中藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中收載的67種動(dòng)物藥中就有蚯蚓，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效[5,12]. 地龍?jiān)趦?chǔ)存不當(dāng)或因其他外界條件影響時(shí)，易受霉菌污染產(chǎn)生黃曲霉毒素，而服用黃曲霉毒素超標(biāo)的地龍對(duì)人體的健康存在較大的危害，因此急需建立地龍藥材中黃曲霉毒素的快速測(cè)定方法. 本文以QuEChERS萃取，EMR-Lipid dSPE 凈化樣品，建立了液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定中藥材地龍中4種黃曲霉毒素的檢測(cè)方法. 該方法去脂除雜效果良好，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷，能夠?yàn)闄z測(cè)中藥材地龍的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐.

1 試驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

1290-6460C超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源(美國(guó)安捷倫有限公司)；分析天平(梅特勒)；容量瓶(天玻儀器有限公司)；渦旋混合器(美國(guó)Scientific)；真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；移液器：20、100 μL及1 mL(德國(guó)Eppendorf公司)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超聲波清洗器(寧波新芝有限公司)；超純水(美國(guó)Millipore公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二胺四乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；EMR-Lipid分散固相萃取管(美國(guó)安捷倫有限公司).

對(duì)照品：黃曲霉毒素M1(批號(hào)：18377-004，純度：100.0%)購(gòu)自Bepure，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：黃曲霉毒素B1、B2、G1(批號(hào)：SSBG004，純度：100.0%)購(gòu)自FERMENTEK. 供試樣品來(lái)源于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的干燥地龍藥材粉末.

1. 2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；進(jìn)樣量： 2 μL；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液；流動(dòng)相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫：0～3 min，10%～30% B；3～5 min，30%～90% B；5～7 min，90% B；7～8 min，90%～10% B；8～9 min，10% B.

1. 3 質(zhì)譜條件

離子源模式：電噴霧離子源正離子模式；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；霧化氣：N2；干燥氣流速：8 L/min；噴霧電壓：500 V；氣流溫度：325 ℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃. 質(zhì)譜條件如表1所列.

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main mass spectral parameters

1. 4 溶液制備

1. 4. 1 EDTA緩沖液配制

檸檬酸8.4 g，磷酸氫二鈉7.1 g，Na2EDTA 19.5 g，溶于650 mL水中，超聲溶解。

1. 4. 2 對(duì)照溶液制備

分別精密移取質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL的黃曲霉毒素M11.00 mL，質(zhì)量濃度依次為0.51、0.50、0.51 μg/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.00 mL至10.00 mL棕色容量瓶，使用乙腈稀釋，并定容至刻度，配制成M1、B1、B2、G1的質(zhì)量濃度依次為50、51、50、51 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液. 準(zhǔn)確吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液2.00 mL至5.00 mL棕色容量瓶中，使用乙腈稀釋，并定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為 20 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，置4 ℃冷藏備用.

1. 4. 3 供試品溶液制備

提取：準(zhǔn)確稱取干燥樣品1 g于50 mL離心管中，加入3 mL EDTA緩沖液和陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉，充分渦旋2 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液待凈化.

凈化：準(zhǔn)確吸取上述上清液2.00 mL于 EMR-Lipid dSPE 凈化管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min，取上層清液過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定.

1. 4. 4 陰性樣品溶液的制備

取未檢出黃曲霉毒素的樣品按照“1. 4. 3供試品溶液制備”步驟同法制成陰性樣品溶液，即空白基質(zhì)樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2. 1 前處理?xiàng)l件選擇

動(dòng)物源性中藥材地龍主要富含蛋白質(zhì)和脂類，因此，前處理主要是去除樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂肪.常見(jiàn)去除蛋白質(zhì)的方法是蛋白質(zhì)沉淀，而蛋白質(zhì)沉淀常見(jiàn)的是加鹽層析，故在本研究中選擇QuEChERS 鹽包法.而EMR-Lipid分散固相萃取是一種新型增強(qiáng)型脂類去除手段，同時(shí)無(wú)需活化、清洗和洗脫等傳統(tǒng)SPE步驟，簡(jiǎn)化了凈化流程，節(jié)約了時(shí)間和成本，故本研究選擇EMR-Lipid分散固相萃取管去除樣品中的脂類成分.

由于4種黃曲霉毒素都在乙腈中具有良好的溶解性，另外，乙腈也能使蛋白質(zhì)變性沉淀，因此以乙腈為提取溶劑. 為了使地龍干燥粉末樣品在加入提取溶劑后具有良好的分散性，在加入乙腈之前，先加入3 mL EDTA緩沖鹽溶液. 該緩沖鹽溶液能夠吸收地龍粉末樣品中其他水溶性雜質(zhì)，如糖類、維生素和無(wú)機(jī)鹽等，在加入萃取鹽包后，通過(guò)離心使水相和有機(jī)相分層，水相被吸附到鹽中，同時(shí)，鹽使蛋白質(zhì)變性凝聚，通過(guò)離心從而有效去除雜質(zhì).

2. 2 色譜條件優(yōu)化

由于黃曲霉毒素屬于中等極性化合物，因此，選擇了適用于各種分析物的ACQUITY BEH C18超高效色譜柱. 在流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化上，為了提高被分析物在電噴霧源正離子模式下的離子化效率，選擇在水相和有機(jī)相中同時(shí)加入離子化劑甲酸. 為穩(wěn)定水相和改善峰型，選擇在水相中加入適宜濃度的乙酸銨. 最終本方法采用含有0.1%甲酸的乙腈溶液與含有0.1%甲酸-2 mmol乙酸銨的水溶液作為流動(dòng)相.

2. 3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究選擇將標(biāo)準(zhǔn)品直接注入質(zhì)譜儀，在正離子模式下，進(jìn)行Scan掃描，確定母離子，后進(jìn)行SIM掃描，選取豐度比最高且相對(duì)穩(wěn)定的兩個(gè)碎片離子分別作為定性離子和定量離子，然后利用MassHunter采集軟件，以手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式同時(shí)優(yōu)化定性和定量離子、碰撞能量、裂解電壓等參數(shù)，最后對(duì)影響離子化效率的毛細(xì)管電壓、干燥器溫度、鞘氣溫度、鞘氣流量、霧化器壓力等條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得各化合物最佳的質(zhì)譜條件.

2. 4 總離子流圖及MRM

以MRM 模式監(jiān)測(cè)4種黃曲霉毒素的定性和定量離子對(duì)，共有8個(gè)離子監(jiān)測(cè)通道. 其標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖如圖 1所示.由圖1可見(jiàn)，各個(gè)化合物峰形對(duì)稱，每個(gè)檢測(cè)通道無(wú)干擾，定量準(zhǔn)確可靠.

圖1 黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms of aflatoxin M1、B1、B2、G1

2. 5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，使用空白基質(zhì)樣品溶液稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，得到質(zhì)量濃度為0.00、0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，外標(biāo)法定量，以X軸為濃度，Y軸為峰面積的響應(yīng)值，得到各個(gè)被分析物的線性回歸方程，用于計(jì)算實(shí)際樣品中待測(cè)物的濃度. 取陰性樣品，混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過(guò)最小添加量，按“1. 4. 3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法同法處理后上機(jī)進(jìn)樣，以3 倍信噪比計(jì)算各個(gè)被分析物的檢出限(LOD )，以10 倍信噪比計(jì)算各個(gè)被分析物的定量限(LOQ ). 4種黃曲霉毒素的線性關(guān)系、檢出限、定量限如表2所列. 結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素在0.00～1.60 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.990 0)，檢出限范圍為0.013～0.365 ng/g，定量限范圍為0.044～0.913 ng/g.

2. 6 回收率及精密度考察

陰性樣品中添加2、4、10 ng 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)添加水平平行制備3份，按“1. 4. 3供試品溶液制備”進(jìn)行處理，得到添加質(zhì)量濃度分別為0.20、0.40、1.00 ng/mL的加標(biāo)溶液，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果如表2所列.由表2可見(jiàn)，4種被分析物的平均回收率為72.0%～113.0%，精密度為2.5%～3.3%.

表2 4種黃曲霉毒素的線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率、精密度Table 2 Linear relationships, LOD, LOQ, recoveries and precisions of 4 aflatoxins

2. 7 樣品測(cè)定

實(shí)際測(cè)試樣品購(gòu)買(mǎi)于中藥材流通市場(chǎng)，樣品為干燥的地龍粉末，采用本研究方法測(cè)定10批地龍樣品中的黃曲霉毒素，結(jié)果顯示，測(cè)試樣品中未檢出上述4種黃曲霉毒素，部分測(cè)試樣品的總離子流圖如圖2所示，測(cè)試樣品信息如表3所列.

圖2 測(cè)試樣品總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of test samples

表3 測(cè)試樣品信息及測(cè)定結(jié)果Table 3 Information of test samples and determination results

3 結(jié)論

本文建立了一種基于QuEChERS和dSPE聯(lián)用的前處理技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性中藥材地龍中4種黃曲霉毒素. 方法學(xué)考察及實(shí)際樣品檢測(cè)證明，該方法去除基質(zhì)效果良好，具有操作簡(jiǎn)單便捷、靈敏度高、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)節(jié)約了成本和時(shí)間，縮短了檢測(cè)周期，能夠滿足對(duì)地龍中多種黃曲霉毒素的檢測(cè)要求，適用于地龍中黃曲霉毒素的快速篩查.