胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷兔子模型對(duì)心肌細(xì)胞增殖、血流動(dòng)力、心肌成纖維增生及心功能的變化

馮衛(wèi)中 徐鵬 張金堂

[摘要] 目的 探討胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷兔子模型心肌細(xì)胞增殖、血流動(dòng)力、心肌成纖維增生及心功能的變化。 方法 隨機(jī)選取清潔級(jí)健康成年新西蘭大白兔60只，將兔子隨機(jī)分為假手術(shù)組及模型組兩組，每組兔子30只。假手術(shù)組開(kāi)胸后不結(jié)扎胸主動(dòng)脈，模型組開(kāi)胸后分離胸主動(dòng)脈。分別測(cè)定各組兔子血流動(dòng)力學(xué)和心功能指標(biāo)水平、心重指數(shù)和心肌細(xì)胞體積水平、心肌細(xì)胞增殖情況、心肌組織形態(tài)變化以及各組心肌膠原含量以及各組血清腦鈉肽（BNP）、氨基端前腦鈉肽（NT-proBNP）水平。 結(jié)果 與假手術(shù)組對(duì)比，模型組兔子LVSP、LVDP、動(dòng)脈收縮壓及動(dòng)脈舒張壓、BNP、NT-proBNP水平、心重指數(shù)、細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯升高，心肌細(xì)胞體積、CVF-V、CVF-NV含量均明顯增加，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均明顯減低（P<0.05或P<0.01）。假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列正常，細(xì)胞核呈橢圓形，心肌間質(zhì)無(wú)明顯增生，心肌纖維走形整齊、結(jié)構(gòu)清晰;模型組部分心肌細(xì)胞周?chē)Y(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核固縮，心肌纖維排列紊亂，纖維增生肥大、斷裂。 結(jié)論 胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷兔子模型能夠抑制心肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)心肌成纖維增生，對(duì)兔子血流動(dòng)力及心功能均產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。

[關(guān)鍵詞] 胸主動(dòng)脈縮窄術(shù);壓力超負(fù)荷;心肌細(xì)胞增殖;血流動(dòng)力;心肌成纖維增生;心功能

[Abstract] Objective To investigate the changes of myocardial cell proliferation， hemodynamics， myocardial fibroblast hyperplasia and cardiac function in rabbits with pressure overload replicated by thoracic aortic coarctation. Methods A total of 60 clean healthy adult New Zealand rabbits were randomly selected and divided into two groups： the sham operation group（n=30） and the model group（n=30）. The sham operation group was not ligated the thoracic aorta after thoracotomy， while the model group was separated the thoracic aorta after thoracotomy. Hemodynamics and cardiac function index level， cardiac weight index and myocardial cell volume level， myocardial cell proliferation， myocardial tissue morphological changes， myocardial collagen content， serum brain natriuretic peptide（BNP） and amino-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP） levels in each group were measured respectively. Results Compared with the sham operation group， LVSP， LVDP， arterial systolic pressure and diastolic pressure， BNP， NT-proBNP level， cardiac weight index and cell proliferation index in the model group significantly raised. The myocardial cell volume， CVF-V， CVF-NV content were significantly increased， and +dp/dtmax and -dp/dtmax levels were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. In the sham operation group， myocardial cells were arranged normally， nucleus was oval， myocardial interstitium did not proliferate obviously， and myocardial fibers had regular shape and clear structure. In the model group， the peripheral structure of some myocardial cells was unclear， nucleus shrinked， myocardial fibers were disordered， and fibers proliferated， hypertrophied and fractured. Conclusion The pressure overload rabbit model reproduced by thoracic aortic coarctation can inhibit myocardial cell proliferation and promote myocardial fibroblast hyperplasia， which has a serious impact on rabbits′ hemodynamics and cardiac function.

[Key words] Thoracic aortic coarctation; Pressure overload; Myocardial cell proliferation; Hemodynamics; Myocardial fibroblast hyperplasia; Cardiac function

心肌肥厚是心肌對(duì)高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死等多種原因造成的壓力或容量超負(fù)荷的一種基本應(yīng)答，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心肌間質(zhì)組織增生等，使心臟的順應(yīng)性及循環(huán)泵功能明顯降低[1]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚與多種心血管疾病的發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，其在代償初期往往能夠維持正常的室壁張力，但長(zhǎng)期的心肌肥厚會(huì)明顯增加心衰和猝死的發(fā)生率，心肌肥厚可作為心肌缺血、心律失常以及猝死等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。心肌肥厚是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制尚不明確，認(rèn)為主要與心肌負(fù)荷過(guò)重、心肌壞死纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、神經(jīng)內(nèi)分泌、基因改變以及環(huán)境等因素有關(guān)[3]。據(jù)報(bào)道，在心肌肥厚的啟動(dòng)機(jī)制方面，壓力或容量超負(fù)荷對(duì)心肌細(xì)胞膜產(chǎn)生的牽張作用被室壁的機(jī)械感受器所感受，經(jīng)細(xì)胞骨架或牽張激活的離子通路轉(zhuǎn)入胞內(nèi);此外，壓力或容量超負(fù)荷還會(huì)使細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等神經(jīng)體液因素的釋放明顯增多[4-5]。目前，心臟瓣膜置換術(shù)是治療瓣膜疾病的主要方式，但其對(duì)于部分以主動(dòng)脈瓣狹窄為主的心臟疾病術(shù)后心臟舒張功能的恢復(fù)效果不佳，其中，主動(dòng)脈瓣狹窄為主聯(lián)合瓣膜病患者心肌纖維化程度尤其嚴(yán)重[6]。因此本組研究主要采用胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷左心肥厚兔子模型，旨在探討其對(duì)心肌細(xì)胞增殖、血流動(dòng)力、心肌成纖維增生及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取清潔級(jí)健康成年新西蘭大白兔60只[江蘇振林生物科技有限公司，SCXK（蘇）2019-0002]，月齡4個(gè)月，體重（1960.17±132.32）g，在實(shí)驗(yàn)室溫度（24±3）℃、濕度（45±5）%、晝夜時(shí)間各12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

超低溫冰箱（北京艾澤信科技有限公司，型號(hào)：DW-86L288）;電子天平（上海友縝電子科技有限公司，型號(hào)：BSM）;電子顯微鏡（濟(jì)寧市鑫兗礦山機(jī)械設(shè)備有限公司，型號(hào)：SZ-139）;電熱恒溫水箱（蘇州凱特爾儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：K-WHS）;石蠟切片機(jī)（北京盛科信德科技有限公司，型號(hào)：RM2235）;低溫高速離心機(jī)（山東博科科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：TG-16M）;超凈工作臺(tái)（山東博科科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BBS-H1100）;多普勒超聲測(cè)定儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)：LSH10-1）;全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：AU5800）;戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司，規(guī)格：1 mg/mL）;二甲苯（張家港澤潤(rùn)欣化工有限公司）;蘇木素-伊紅染液（HE）（上海信帆生物科技有限公司）。

1.3建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

將兔子隨機(jī)分為假手術(shù)組及模型組兩組，每組兔子30只。

建立動(dòng)物模型：將兔子禁食4 h后經(jīng)耳緣靜脈注射30 mg/mL 3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，當(dāng)兔子后肢腳蹬反射消失后，取仰臥位，將其固定于工作臺(tái)上。剔除頸部毛發(fā)，剪開(kāi)頸部皮膚進(jìn)行氣管插管。將兔子胸部毛發(fā)剔除，消毒，沿胸骨中線偏左剪開(kāi)皮膚并逐層分離肌肉，打開(kāi)胸腔（過(guò)程中避開(kāi)肋間動(dòng)脈），取開(kāi)胸器固定，暴露升主動(dòng)脈，分離主動(dòng)脈弓周?chē)芗敖Y(jié)締組織。定位分離胸主動(dòng)脈，使用無(wú)菌聚乙烯塑料管墊扎約50%，排除胸腔空氣，逐層縫合肌肉及皮膚。當(dāng)兔子恢復(fù)自主呼吸后，拔出氣管插管。術(shù)后正常飲食，連續(xù)3 d注射青霉素防止感染。假手術(shù)組開(kāi)胸后不結(jié)扎胸主動(dòng)脈，其余步驟同模型組相同。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

心功能：每組取5只兔子，采用多普勒超聲測(cè)定儀測(cè)定各組左心室舒張壓（Left ventricular diastolic pressure，LVDP）、左心室收縮壓（Left ventricular systolic pressure ，LVSP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）及左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）變化。

血流動(dòng)力學(xué)：采用多普勒超聲測(cè)定儀測(cè)定各組兔子動(dòng)脈收縮壓、動(dòng)脈舒張壓、心率等的變化。

每組取5只兔子，取出心臟，去除血管、脂肪等多余組織，吸干水分后稱(chēng)重，計(jì)算各組兔子心重指數(shù)。心重指數(shù)=心臟重量/體重。將心臟切碎，離心，在顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的長(zhǎng)度、厚度及寬度，計(jì)算各組心肌細(xì)胞體積變化。心肌細(xì)胞體積=[π×（寬度÷2）×（厚度÷2）]×1。

采用免疫組化法測(cè)定兩組兔子增殖細(xì)胞抗原（Proliferating cell antigen，PCNA）表達(dá)水平。每組取5只兔子，取出心臟，將其放入福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，常規(guī)制作石蠟切片，將組織切片在60℃烤箱中烤約30 min，使用二甲苯脫蠟、酒精脫水，加入0.01 mol/L檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下靜置30 min，5%羊血清封閉，去除血清加一抗在4℃條件下孵育過(guò)夜，加入二抗，使用磷酸鹽緩沖液沖洗，免疫組化染色、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。在顯微鏡下進(jìn)行觀察。取細(xì)胞分布均勻的5個(gè)視野，每個(gè)視野下約200細(xì)胞，觀察、記錄各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

采用HE染色法觀察各組心肌組織形態(tài)變化。每組取5只兔子，取其心臟，常規(guī)制作石蠟切片，放入60℃左右烤箱中烤干，使用二甲苯脫蠟、酒精脫水，蘇木素染色約5 min，流水沖洗，蒸餾水浸泡10 min，伊紅染色3 min，脫水、透明、樹(shù)膠封片。使用顯微鏡進(jìn)行觀察記錄。

每組取5只兔子，采用組織光度法測(cè)定各組心肌膠原含量，心肌膠原含量采用膠原容積分?jǐn)?shù)（Collagen volume fraction，CVF）表示，包括CVF-V、CVF-NV。

將剩余5只兔子取腹主動(dòng)脈血5 mL，靜置離心，取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組血清腦鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）、氨基端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）水平。

1.5觀察指標(biāo)

測(cè)定各組兔子心功能（LVDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax）水平、血流動(dòng)力學(xué)（動(dòng)脈收縮壓、動(dòng)脈舒張壓、心率）水平、心重指數(shù)、心肌細(xì)胞體積、PCNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖指數(shù)、心肌組織形態(tài)變化、心肌膠原含量（CVF-V、CVF-NV）以及血清BNP、NT-proBNP水平變化。采用免疫組化法測(cè)定兩組兔子心肌細(xì)胞增殖情況。采用多普勒超聲測(cè)定儀測(cè)定各組兔子血流動(dòng)力學(xué)及心功能指標(biāo)水平。采用HE染色法觀察各組心肌組織形態(tài)變化。采用組織光度法測(cè)定各組心肌膠原含量。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組血清BNP、NT-proBNP變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本組研究中計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，比較均采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以（x±s）表示，比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組兔子心功能指標(biāo)比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組兔子LVSP、LVDP水平均明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均明顯減低（P<0.01或P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組兔子血流動(dòng)力學(xué)比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組兔子動(dòng)脈收縮壓及動(dòng)脈舒張壓均明顯升高（P<0.01），兩組心率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組兔子心重指數(shù)及心肌細(xì)胞體積比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組心重指數(shù)及心肌細(xì)胞體積均明顯增加（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 各組兔子心肌細(xì)胞增殖情況比較

細(xì)胞陽(yáng)性主要表達(dá)于細(xì)胞核中，染色呈棕黃色。模型組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）。見(jiàn)表4。

2.5 各組兔子心肌組織形態(tài)變化

假手術(shù)組：心肌細(xì)胞呈桿狀，心肌細(xì)胞排列正常，細(xì)胞核呈橢圓形，心肌間質(zhì)無(wú)明顯增生，心肌纖維走形整齊、結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)擴(kuò)張及血管壁增厚。模型組：心肌細(xì)胞變形、部分心肌細(xì)胞周?chē)Y(jié)構(gòu)不清，心肌細(xì)胞核固縮，心肌纖維排列紊亂，間隙增寬，纖維增生肥大、斷裂。見(jiàn)封三圖4。

2.6各組CVF-V、CVF-NV水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組心肌CVF-V、CVF-NV含量明顯增高（P<0.01）。見(jiàn)表5。

2.7各組血清BNP、NT-proBNP水平比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組兔子血清BNP、NT-proBNP水平均明顯升高（P<0.01）。見(jiàn)表6。

3 討論

心肌肥厚是常見(jiàn)于壓力負(fù)荷長(zhǎng)期增加的疾病，如高血壓、主動(dòng)脈狹窄等，它是心臟的一種代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增大、間質(zhì)細(xì)胞增生、間質(zhì)膠原沉積以及心臟重量增加等[7]。心肌肥厚發(fā)生的機(jī)制是心臟對(duì)長(zhǎng)期增加的壓力負(fù)荷產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)導(dǎo)致，在負(fù)荷過(guò)重的刺激下，通過(guò)增加肌肉組織的體積，以適應(yīng)工作負(fù)荷的增加[8]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，心臟結(jié)構(gòu)性適應(yīng)不只是有量的增加，還伴有質(zhì)的變化;不只是心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及膠原纖維等也發(fā)生了明顯的改變[9-10]。本研究主要采用胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷兔子模型，并對(duì)其心肌細(xì)胞增殖、血流動(dòng)力、心肌成纖維增生及心功能產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析。

心臟是人和脊椎動(dòng)物身體血液循環(huán)的中樞，也是生命得以維持的基礎(chǔ)。它負(fù)責(zé)提供將血液推進(jìn)身體各個(gè)部分的動(dòng)力，給身體的組織器官提供充足的血流量，使細(xì)胞能夠維持正常的代謝及功能[11]。本研究中建立動(dòng)物模型后，通過(guò)超聲心電圖對(duì)心臟進(jìn)行連續(xù)的、反復(fù)的觀察及血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組動(dòng)脈收縮壓、動(dòng)脈舒張壓、LVSP、LVDP等均明顯高于假手術(shù)組，+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于假手術(shù)組（P<0.05），提示胸主動(dòng)脈縮窄會(huì)對(duì)血流動(dòng)力及心功能產(chǎn)生明顯影響，LVDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等是反映心功能的重要指標(biāo)。

反映心肌細(xì)胞增殖的指標(biāo)有很多，PCNA又稱(chēng)細(xì)胞周期素或DNA聚合酶輔助因子，是主要存在于細(xì)胞核中的一種酸性蛋白，它可以作為DNA聚合酶的輔助因子與作為DNA修復(fù)相關(guān)的輔助因子，在DNA復(fù)制和細(xì)胞周期過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，在啟動(dòng)細(xì)胞增殖中扮演著重要角色[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的壓力負(fù)荷除了能夠引起心臟、血管結(jié)構(gòu)功能的改變，還可以引起心肌成纖維化增生[14]。心肌成纖維化增生會(huì)導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低，心肌細(xì)胞供氧減少，膠原纖維明顯增加;過(guò)量增生的膠原纖維會(huì)將心肌細(xì)胞緊密包圍，心肌舒張及收縮功能進(jìn)一步受損[15-16]。Hui-Hua等[17]研究表明，膠原纖維在維持心臟正常功能方面起著與心肌細(xì)胞同等重要的作用，對(duì)心肌細(xì)胞起支持、排列等作用，是心肌硬度的決定因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胸主動(dòng)脈縮窄能夠使心肌肥厚、心肌細(xì)胞體積增大、心肌成纖維增生，對(duì)心肌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過(guò)度激活造成的系統(tǒng)反應(yīng)與心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。BNP、NT-proBNP均為神經(jīng)內(nèi)分泌激素，主要由心肌細(xì)胞合成，其分泌受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)控。當(dāng)心室功能不全時(shí)，BNP、NT-proBNP水平明顯升高。BNP、NT-proBNP是反映心力衰竭及其預(yù)后的重要預(yù)測(cè)性指標(biāo)[19-20]。本研究結(jié)果中，模型組BNP、NT-pro BNP水平明顯高于假手術(shù)組（P<0.05），提示胸主動(dòng)脈縮窄能夠明顯使心臟神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)度激活，促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生，與相關(guān)文獻(xiàn)[15]研究結(jié)果一致。

綜上所述，胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制壓力超負(fù)荷兔子模型，能夠使心肌細(xì)胞明顯增大、抑制心肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)心肌成纖維增生，對(duì)兔子血流動(dòng)力及心功能均產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。

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（收稿日期：2020-04-17）