微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的來(lái)源與生物工程技術(shù)研究進(jìn)展

張秀江，權(quán)淑靜，向凌云，劉 麗，解復(fù)紅，馮 菲，胡 虹*

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450008）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）在動(dòng)物、植物和微生物的機(jī)體組織中廣泛存在，能夠催化肽鏈的谷氨酰胺殘基中的γ-羧酰胺基和酰基受體發(fā)生轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，促使蛋白質(zhì)或多肽之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[1]，改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、彈性、穩(wěn)定性和凝膠強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)不同質(zhì)地和不同風(fēng)味的蛋白食品生產(chǎn)[2]。根據(jù)來(lái)源不同分為兩類，來(lái)源于動(dòng)植物組織的稱為組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（tissue transglutaminase，TTGase），來(lái)源于微生物發(fā)酵制備的稱為微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（microbial transglutaminase，MTGase）。MTGase不需要Ca2+的存在而起作用，分子質(zhì)量多數(shù)在40 kDa左右，在pH 5～9范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性和較高的酶活性，耐熱的穩(wěn)定性也較強(qiáng)[3]。MTGase屬胞外酶，微生物發(fā)酵過(guò)程中可直接分泌到培養(yǎng)物中，酶的分離純化較TTGase更容易。MTGase在食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、化妝品、紡織工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，是各種新型蛋白質(zhì)類制品生產(chǎn)和加工環(huán)節(jié)一種非常重要的酶制劑[4-5]。MTGase發(fā)酵生產(chǎn)具有原料來(lái)源廣、成本低、周期短，可以不受環(huán)境條件制約進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)而受到廣泛關(guān)注，成為生物酶制劑領(lǐng)域研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)產(chǎn)品。近三十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在MTGase產(chǎn)酶微生物、MTGase基因、產(chǎn)酶工程菌株構(gòu)建與表達(dá)以及MTGase的分子改造技術(shù)等領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究工作，取得了不少進(jìn)展。本文就MTGase的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及生物工程領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對(duì)生物工程技術(shù)應(yīng)用于MTGase的產(chǎn)品生產(chǎn)進(jìn)行了展望，為高效和低成本MTGase的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供新的思路和方法。

1 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

為提高M(jìn)TGase的產(chǎn)量和酶活，圍繞著產(chǎn)酶微生物菌株的篩選和誘變技術(shù)進(jìn)行了大量研究工作。MTGase最先在茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182中分離得到，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品規(guī)模化生產(chǎn)及商品化應(yīng)用[3]。隨后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)鏈輪絲菌屬（Streptoverticillium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的多個(gè)菌株都能分泌MTGase，如肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneu）、拉達(dá)卡鏈輪絲菌（Streptoverticillium ladakanum）、吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus）等[6]。DE BARROS L H等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）也具備分泌MTGase功能。MTGase菌株商業(yè)化開(kāi)發(fā)利用方面，除日本味之素的茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182菌株外，還有荷蘭微生物菌保中心的肉桂鏈霉菌（Streptomyces cinnamoneum）CBS683.68菌株、丹麥諾和諾德公司的利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus）NRRLB-3446菌株和扁平鏈霉菌（Streptomyces platensis）DSM40041菌株以及日本大阪發(fā)酵研究所的黎巴嫩鏈霉菌（Streptomyces libani）No.13452T菌株等[9-10]。

針對(duì)我國(guó)MTGase商品化應(yīng)用一直沒(méi)有取得生產(chǎn)性能良好且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌株，造成產(chǎn)品生產(chǎn)成本高、價(jià)格昂貴、推廣應(yīng)用困難等技術(shù)難題，許多研究者一方面通過(guò)直接篩選高表達(dá)、高酶活的微生物菌株，另一方面通過(guò)微生物菌種誘變技術(shù)選育高效產(chǎn)酶菌株。祖海珍等[11]通過(guò)N-芐酯基-L-谷氨酰甘氨酸比色法從土壤中分離篩選一株產(chǎn)MTGase灰輪絲鏈輪絲菌（Streptoverticillium griseoverticillatum），酶活達(dá)到7 U/mL。段宇珩[12]對(duì)茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）K21進(jìn)行離子束誘變，篩選出產(chǎn)MTGase酶活達(dá)3.6 U/mL的S2菌株，菌株的產(chǎn)酶能力提高了56.52%。陳國(guó)娟等[13]以灰輪絲鏈輪絲菌（Streptoverticillium griseoverticillatum）ZC03為出發(fā)菌株，采用紫外線及氦（He）-氖（Ne）激光復(fù)合誘變技術(shù)，獲得一株產(chǎn)MTGase性能穩(wěn)定、酶活顯著提高的ZC60菌株。夏書(shū)琴等[14]采用大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變技術(shù)對(duì)茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）03-10進(jìn)行誘變，選育出產(chǎn)MTGase突變菌株G2-1，酶活達(dá)2.73 U/mL，比原菌株提高82%。陳佳[15]采用紫外線和亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）聯(lián)合誘變技術(shù)結(jié)合96孔板篩選技術(shù)對(duì)茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）進(jìn)行誘變，選育出2株產(chǎn)MTGase生產(chǎn)性能分別提高45.4%和55.9%的誘變菌株。張瑩等[16]利用紫外-硫酸二乙酯復(fù)合誘變技術(shù)處理茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis），輔以高通量技術(shù)篩選MTGase高產(chǎn)菌株，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)誘變選育的菌株最高酶活達(dá)7.02 U/mL，比原菌株提高54%。郭瑋婷等[17]利用NTG誘變技術(shù)結(jié)合96孔板高通量篩選方法從茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中篩選到5株產(chǎn)MTGase耐熱穩(wěn)定性較高的突變菌株。田淑翠[18]對(duì)茂原鏈霉菌（Streptoymy-ces mobaraensis）HS47進(jìn)行紫外線（ultraviolet，UV）、NTG和常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變，篩選出一株產(chǎn)MTGase酶活為7.7 U/mL的高產(chǎn)菌株，酶活比原始菌株提高了3.08倍。蔣瑩[19]利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)對(duì)茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）ECU7480進(jìn)行多輪迭代誘變，選育的菌株發(fā)酵產(chǎn)MTGase酶活比原菌株提高了19%～27%，且經(jīng)8次傳代仍保持較高的產(chǎn)酶能力。張瑩瑩等[20]從土壤中分離細(xì)菌，經(jīng)過(guò)酪蛋白凝膠反應(yīng)初篩和Folk比色法測(cè)定酶活復(fù)篩，得到一株產(chǎn)MTGase的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）TGase1318，其所產(chǎn)MTGase耐高溫性能較好。宋佳雯等[21]采用基因組重排技術(shù)，通過(guò)兩輪基因組重排，輔以96孔板發(fā)酵高通量篩選和搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，獲得一株產(chǎn)MTGsae酶活達(dá)7.12 U/mL的茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）菌株，產(chǎn)MTGase酶活平均提高65.5%。葉堅(jiān)[22]用ARTP和UV復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)解朊金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）PF-Y0360進(jìn)行誘變，獲得菌株AU-J0789，產(chǎn)MTGase酶活較原菌株提高137%。

2 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶工程菌株的構(gòu)建和表達(dá)

2.1 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因

到目前為止，MTGase的微生物編碼基因共有數(shù)十種得到了分離和測(cè)序，以茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182 的基因研究最為系統(tǒng)明確[3]，該基因全長(zhǎng)1 249 bp，核苷酸的編碼序列為+20～+1 237的1 218 bp核苷酸序列，共編碼406個(gè)氨基酸殘基，半胱氨酸活性位點(diǎn)處于氨基酸序列的64位，因此MTGase應(yīng)歸屬于蛋白酶類。儀朝印等[23]以茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），獲得1條993 bp的基因片段，從第46個(gè)堿基開(kāi)始對(duì)ATG編碼氨基酸，編碼由316個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。劉松等[24]通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13TGase基因，該基因開(kāi)放閱讀框共編碼418 個(gè)氨基酸（aa），由信號(hào)肽（29 aa）、酶原區(qū)（57 aa）及TGase（332 aa）組成。在TGase開(kāi)放閱讀框上游約500 bp有一個(gè)啟動(dòng)子序列，在TGase開(kāi)放閱讀框下游12 bp處有一個(gè)TGase基因轉(zhuǎn)錄的終止子。張宇[25]研究發(fā)現(xiàn)，吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）St4MTG基因編碼長(zhǎng)為1 251 bp，第149位氨基酸Cys為活性中心位點(diǎn)，成熟MTGase分子中催化三聯(lián)體為Cys149-His359-Asp346。DURAN R等[26]分離了肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneum）CBS683.68的MTGase基因，蛋白質(zhì)前體由一條81個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和一個(gè)330個(gè)氨基酸殘基組成的成熟MTGase。王玉等[27]克隆了來(lái)自于拉達(dá)克輪絲菌（Streptoverticillium ladakanum）B1的MTGase基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到MTGase的前導(dǎo)肽（pro）和除前導(dǎo)肽以外成熟的MTGase基因，長(zhǎng)度在1 200～2 000 bp。

芽孢桿菌屬（Bacillus）MTGase基因的發(fā)現(xiàn)，使得開(kāi)發(fā)不同種類和不同特性的MTGase成為可能。KOBAYASHI K等[28]最早在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中研究發(fā)現(xiàn)和克隆了MTGase的基因，但發(fā)現(xiàn)MTGase的基因沒(méi)有信號(hào)肽。張瑩瑩等[20]用PCR方法克隆了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）TGase1318編碼基因tgl，序列長(zhǎng)738 bp，編碼由245個(gè)氨基酸組成。余小娜[29]從產(chǎn)酶菌株MEPE0134中獲得MTGase基因，用PCR方法擴(kuò)增出基因tgl序列長(zhǎng)750 bp，測(cè)序分析表明該基因與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的相似性最高。

2.2 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶工程菌株的構(gòu)建和表達(dá)

由于天然微生物菌株產(chǎn)MTGase能力不強(qiáng)，雖經(jīng)篩選和誘變技術(shù)處理在一定程度上可以提高菌株產(chǎn)酶能力，但很難達(dá)到商品化生產(chǎn)的要求，構(gòu)建基因工程菌株是提高M(jìn)TGase酶活和產(chǎn)量的有效途徑。日本味之素公司、德國(guó)Martin-Luther 大學(xué)、臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、江南大學(xué)、華東師范大學(xué)、華東理工大學(xué)以及諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司等先后開(kāi)展了MTGase工程菌株構(gòu)建及表達(dá)方面的研究。表達(dá)研究涉及MTGase成熟酶和酶原（pro-TGase）的表達(dá)以及選擇適宜的宿主、共表達(dá)融合酶蛋白、共表達(dá)酶原區(qū)等。大多數(shù)鏈霉菌類和部分芽孢桿菌類MTGase基因已在大腸桿菌、酵母菌、鏈霉菌、芽孢桿菌及棒桿菌等宿主中實(shí)現(xiàn)成功表達(dá)[24]。

2.2.1 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶工程菌株的構(gòu)建和表達(dá)

WASHIZU K等[30]將茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-8112的MTG產(chǎn)酶基因?qū)胱冦U青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中取得成功表達(dá)。KIKUCHI Y等[31]將來(lái)源于茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense）SAMP45基因轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，該基因還可以對(duì)MTGase前體酶原蛋白進(jìn)行定點(diǎn)改造，最終得到活性較高的MTGase。MARX C K等[32]將來(lái)源于茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原（pro-MTG）蛋白在大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)乳糖和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）低溫誘導(dǎo)，表達(dá)量分別達(dá)到65 mg/L和4.5 mg/L，酶活分別達(dá)到627 U/g和447 U/g，乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)量和酶活顯著優(yōu)于IPTG誘導(dǎo)。NODA S等[33]將肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneum）的MTGase基因轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中并成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，以木糖作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，重組工程菌的MTGase產(chǎn)量達(dá)到530 g/L。ITAYA H等[34]將來(lái)源于茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在不同的棒桿菌中進(jìn)行重組，發(fā)現(xiàn)多數(shù)種類的棒桿菌都能高效表達(dá)MTGase。YURIMOTO H等[35]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在甲醇酵母中得到成功表達(dá)，同時(shí)還在變鉛青鏈霉菌（Streptomyce lividans）、大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等宿主中進(jìn)行表達(dá)[36]。

任增亮等[37]在吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）培養(yǎng)液中分離純化得到MTGase的酶原（pro-MTGase），克隆該酶原基因并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-20b（+）信號(hào)肽pelB的下游，獲得重組表達(dá)載體pET/pro-MTG。重組表達(dá)載體分別在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中進(jìn)行表達(dá)，低溫條件下誘導(dǎo)，獲得胞外可溶性表達(dá)的MTGase酶原，用胰蛋白酶切除酶原前導(dǎo)區(qū)域，獲得有活性的MTGase，最高酶活達(dá)到0.24 U/mL。劉松等[24]將吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13的TGase基因在變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）TK24進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵罐發(fā)酵MTGase酶活達(dá)到3.2 U/mL，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表達(dá)，MTGase酶活達(dá)到6.8 U/mL。舒暢[38]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）來(lái)源的MTGase基因及相關(guān)突變基因在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、激活酶原、鎳（Ni）柱純化等工藝處理，得到6種重組MTGase，最高表達(dá)酶活達(dá)到54.62 U/mL。儀朝印等[23]以茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-MTG，將重組質(zhì)粒在大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行表達(dá)，MTGase最高酶活達(dá)到15.9 U/mL。唐名山[39]從茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）WSH-22中克隆出MTGase基因，在表達(dá)載體pQE-30T中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMTG，將重組質(zhì)粒pMTG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）M15中，在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)MTGase，最高表達(dá)酶活達(dá)到21.3 U/mg。張宇[25]將吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的MTGase基因與大腸桿菌（Escherichia coli）細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體pET-23（a）和pET-32（a）連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-23（a）-MTGase和pET-32（a）-MTGase，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，MTGase酶活表達(dá)達(dá)到10.23 U/mL。張瑩瑩等[20]用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達(dá)載體pTZ，用大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)載體pET21b，分別構(gòu)建含基因tgl的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化為工程菌枯草芽孢桿菌WB800和大腸桿菌（Escherichia coli）BL21，結(jié)果表明基因tgl在大腸桿菌中表達(dá)MTGase的效果比枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）更好。陸姣姣[40]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的基因分別在枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中構(gòu)建組成型和誘導(dǎo)型MTGase表達(dá)載體，并對(duì)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度等因子進(jìn)行優(yōu)化，取得表達(dá)MTGase的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌的工程菌株，表達(dá)的MTGase采用激活酶原和Ni柱純化等處理工藝，得到活性更高的MTGase。研究同時(shí)表明，激活酶原后的MTGase催化大豆分離蛋白的能力更強(qiáng)。

2.2.2 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶融合蛋白為載體的工程菌構(gòu)建和表達(dá)

YU Y J等[41]從鏈霉菌（Streptomyces netropsis）BCRC 12429中克隆到MTGase（Sn TGase）基因，在大腸桿菌中共表達(dá)Sn TGase N 端的前導(dǎo)序列和硫氧還蛋白，重組后MTGase融合蛋白（Trx-proTGase）的表達(dá)量為180 mg/L，牛胰蛋白酶處理，MTGase的酶活達(dá)到24.9 U/mg。黃柯等[42]從茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中克隆MTGase基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-TGase，轉(zhuǎn)至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，構(gòu)建重組大腸桿菌（Escherichia coli）BL21/pGEX-TGase，重組菌在IPTG誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生GST-TGase融合蛋白，實(shí)現(xiàn)MTGase融合蛋白的高效表達(dá)。邵坤彥等[43]以吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增的方法得到MTGase基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEXTGase并轉(zhuǎn)至大腸桿菌（Escherichia coli）中獲得BL21/pGEXTGase重組菌，重組菌通過(guò)乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白，采取稀釋及尿素梯度液相色譜相結(jié)合的方法處理融合蛋白，實(shí)現(xiàn)包涵體融合蛋白復(fù)性，經(jīng)純化處理得到酶活為29 U/mg的MTGase。周建等[44]從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DB403染色體中克隆出MTGase基因，以融合蛋白的形式在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)硫氧還蛋白-MTG融合蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該融合蛋白也具有MTGase的活性，表明產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中可直接添加該融合蛋白，降低MTGase的生產(chǎn)和應(yīng)用成本。劉凱等[45]以枯草芽孢桿菌DNA擴(kuò)增獲得帶有SD序列及谷氨酸棒桿菌信號(hào)肽ΔS0949的BTG基因，將其與大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pXMJ19連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-Sbtg轉(zhuǎn)至谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)該重組菌可以表達(dá)MTGase。

3 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分子改造技術(shù)

MTGase分子改造主要通過(guò)定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變對(duì)MTGase分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變。定點(diǎn)突變改變的目標(biāo)是MTGase活性中心Cys64附近的氨基酸殘基，隨機(jī)突變改變的目標(biāo)是整個(gè)MTGase分子結(jié)構(gòu)。目前獲得MTGase高酶活的突變菌株主要是通過(guò)對(duì)MTGase分子活性中心Cys64附近的氨基酸殘基和其N末端的氨基酸殘基進(jìn)行生物學(xué)改造來(lái)實(shí)現(xiàn)[46-47]。CHEN K 等[48]通過(guò)刪除MTGase分子N末端前4個(gè)Asp、Ala、Ala、Asp的氨基酸殘基，促使MTGase的酶活提高32.92%。LIU S等[49]采用TGase或pelB信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)了吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）來(lái)源的MTGase在大腸桿菌（Escherichia coli）中以酶原的形式進(jìn)行表達(dá)，將酶原N端切掉，形成具有酶的活性MTGase。SHIMBA N等[50]研究表明，MTGase分子N末端的氨基酸殘基適度缺失或被取代，可提高M(jìn)TGase的催化活性。ZOTZEL J等[51]在研究MTGase產(chǎn)生過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬（Streptoymyces）來(lái)源的MTGase，在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)先以酶原（pro-TGase）的形式合成，分泌到胞外通過(guò)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶切除N-端酶原區(qū)后折疊成為具有活性的MTGase。王坤等[52]通過(guò)對(duì)茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）MTGase酶原的基因序列密碼子進(jìn)行改造優(yōu)化，降低基因中鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）的含量，提高其在大腸桿菌（Escherichia coli）中的表達(dá)水平，結(jié)果MTGase酶原的表達(dá)量提高了4.4倍。同時(shí)利用融合PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)將MTGase第二位的絲氨酸改造為脯氨酸，改造后MTGase的酶活提高了1.26倍。任蕊蕊等[53]借助于Discovery Studio 2017軟件分析，確定了茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase與底物α-N-CBZ-GLN-GLY親和力氨基酸位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變處理獲得酶活和催化能力都提高的E300W突變體，突變體表達(dá)的MTGase酶活提高31%。

4 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)及應(yīng)用展望

MTGase具有優(yōu)良的交聯(lián)作用，有助于提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性、乳化性和熱穩(wěn)定性，改善蛋白質(zhì)產(chǎn)品的外觀、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，應(yīng)用前景十分廣闊。產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用方面，酶活的高低對(duì)MTGase的應(yīng)用有重要影響，高效表達(dá)酶活的MTGase生產(chǎn)菌株成為目前研究的重點(diǎn)。研究表明，MTGase高產(chǎn)工業(yè)化應(yīng)用菌株可以通過(guò)篩選新的MTGase微生物高產(chǎn)菌株、對(duì)現(xiàn)有的微生物菌株進(jìn)行誘變提高其產(chǎn)酶性能、構(gòu)建MTGase工程菌株和對(duì)MTGase 進(jìn)行分子改造再構(gòu)建MTGase工程菌株等途徑獲得。構(gòu)建工程菌株是提高M(jìn)TGase產(chǎn)量和酶活的有效手段，通過(guò)生物工程技術(shù)獲得的MTGase菌株產(chǎn)酶性能不易發(fā)生衰退，酶活表達(dá)水平會(huì)更高，可以突破MTGase在天然微生物產(chǎn)酶菌株中酶活表達(dá)水平低，造成MTGase生產(chǎn)和應(yīng)用成本過(guò)高的技術(shù)難題。因此利用生物工程技術(shù)最有希望獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的MTGase工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用菌株，滿足食品、生物醫(yī)學(xué)、化妝品、紡織等領(lǐng)域不斷開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)類新產(chǎn)品應(yīng)用需求，促進(jìn)行業(yè)健康快速發(fā)展。