生物胺降解乳酸菌的篩選與特性研究

王 強(qiáng)，周真江，曾維友，索化夷*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市江津區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，重慶 402260）

生物胺是一類具有生物活性且含氮的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物[1]，主要由微生物的氨基酸脫羧酶對氨基酸（組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）的脫羧作用而形成的有機(jī)化合物（組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）[2]。生物胺對人體具有重要意義，但是攝入過量的生物胺會使得血管擴(kuò)張，導(dǎo)致人體產(chǎn)生痙攣、腹瀉、心悸、嘔吐、頭痛、血壓不穩(wěn)、呼吸紊亂等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可引起人體中毒[3]，而且部分生物胺過量會危害人體健康。所有生物胺中以組胺毒性最大，酪胺次之，本身毒性不高的尸胺能夠增強(qiáng)前兩者的毒性，其原因在于其可以抑制組胺/酪胺代謝酶[4]。因此，對食品中生物胺進(jìn)行防控是極為必要的。

生物胺廣泛存在于各類食品中，尤其是在發(fā)酵食品中占比更高[5]。目前對食品中的生物胺進(jìn)行防控主要從兩方面入手：一是控制食品在生產(chǎn)過程中生物胺的形成，如生產(chǎn)工藝控制[6]、食品添加劑控制[7]、超高壓控制[8]、輻照控制[9]等；二是降解食品在生產(chǎn)過程中已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺，如開發(fā)添加具有生物胺氧化酶活性微生物的新型發(fā)酵劑等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，存在許多具有生物胺氧化酶活性的微生物，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）等，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物對食品中生物胺進(jìn)行防控的方法相比其他方法更加切實(shí)可行，并且穩(wěn)定安全[11]。生物胺的生物降解技術(shù)已經(jīng)在多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中進(jìn)行應(yīng)用，如利用植物乳桿菌可以抑制香腸中生物胺的積累[12]，能顯著降低泰國香腸中的生物胺含量[13]；通過添加植物乳桿菌降解葡萄酒發(fā)酵過程中生成的生物胺[14]。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品多為高鹽高酸性食品，本研究擬通過對乳酸菌的生物胺產(chǎn)生活性、降解能力以及對高鹽高酸性環(huán)境耐受能力的篩選，最終得到可以用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的生物胺降解菌株，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品安全性提升提供可靠的備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)中所用的41株乳酸菌為實(shí)驗(yàn)室前期分離純化、鑒定并保藏的菌株，編號為1～41，保藏在西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS肉湯（固體）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；顯色培養(yǎng)基[15]：NB培養(yǎng)基54 g，磷酸吡哆醛0.05 g，溴甲酚紫0.06 g，6種氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸、精氨酸）各5 g，去離子水1 000 mL，調(diào)pH值至5.2，于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

磷酸吡哆醛（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；溴甲酚紫（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：重慶川東化工有限公司；尸胺、組胺、酪胺（純度均≥98%）：美國Sigma公司；苯甲酰氯（純度≥98%）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸（純度均≥98%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；LDZM-60KCS-II型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-2F型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GHP-9160型恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；5810型高速低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司；PGC-21D型氮吹儀：北京中諾遠(yuǎn)東公司；SYNERGYH1MG型全波長酶標(biāo)儀：美國基因公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的活化、鏡檢

將保藏在安瓿管中的乳酸菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min條件下活化24 h，活化后劃線于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察平板上的菌落形態(tài)，并挑取單菌落于載玻片上均勻涂布，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定菌株為純培養(yǎng)。

1.3.2 菌懸液的制備

試驗(yàn)所用菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，取10 mL乳酸菌培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，棄去上清液，用滅菌生理鹽水洗滌兩次，并將其OD600nm值調(diào)節(jié)為0.8，備用[16]。

1.3.3 生物胺合成活性篩選

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接入到顯色培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，記錄培養(yǎng)基顏色（若為紫色，則菌株初步判定為陽性；若為黃色即不變色，則菌株初步判定為陰性），空白培養(yǎng)基（不接入菌懸液的培養(yǎng)基）作對照組，選取陰性菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.3.4 生物胺降解菌株的篩選

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接種于含三種生物胺（酪胺、腐胺、組胺）各500 μg/mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，以空白培養(yǎng)基（不接入菌懸液的培養(yǎng)基）為對照組，分別取1 mL菌液加入4 mL 0.1 mol/L HCl溶液中斷菌株生長繁殖后，測定生物胺的含量，計(jì)算各菌株的生物胺降解率[17]，其計(jì)算公式如下：

式中：W0為對照組中生物胺的含量，μg/mL；W1為實(shí)驗(yàn)組中生物胺的含量，μg/mL。

1.3.5 生物胺含量的測定[18]

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確稱取尸胺、組胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL，制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取上述生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L HCl溶液配制成質(zhì)量濃度分別為1.0 μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的3種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后進(jìn)行柱前衍生處理后上機(jī)檢測，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）柱前衍生

2 mL三種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液、10 μL苯甲酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后旋渦振蕩30 s，30 ℃水浴條件下避光反應(yīng)40 min，期間每隔10 min振蕩一次。反應(yīng)結(jié)束后用2 mL飽和NaCl溶液中斷反應(yīng)。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min離心10 min，用移液槍移取乙醚層，重復(fù)萃取操作兩次，35 ℃氮?dú)獯蹈桑詈笥? mL甲醇（色譜級）溶解，微濾（0.22 μm）后置于1 mL的液相小瓶中，于4 ℃下保存、待測。

（3）HPLC分析

對比濃縮前后鹵水和透過液的組成，透過液的K，Na，Mg含量占原鹵水含量的百分比分別為0.020 8%，0.016 70%，0.008 45%，說明膜蒸餾對鹵水濃縮有顯著的影響，鹵水中的鹽幾乎截留在了膜的進(jìn)料側(cè)。測得鹵水濃縮后的透過液的電導(dǎo)率是0.048～1.682 ms/cm，對比純凈水的電導(dǎo)率是 0～10 μs/cm，飲用水的電導(dǎo)率是 0～50 μs/cm，一般家用自來水的電導(dǎo)率為125～1 250 μs/cm，實(shí)驗(yàn)表明：膜蒸餾實(shí)驗(yàn)得到的透過液達(dá)到生活用水的標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)錢茜茜等[19]的實(shí)驗(yàn)方法略作修改，色譜柱為Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為超純水，流動相B為甲醇，紫外檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min，采用梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.6 生物胺降解菌株耐鹽性能測定

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接種于含不同NaCl（0、5%、7%、9%、11%）的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值），以不含NaCl且不接種菌的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對照，計(jì)算各菌株在不同NaCl含量條件下的生長效率[16]，其計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對照組的OD600nm值；A1為不含NaCl培養(yǎng)液的OD600nm值；A2為含不同濃度NaCl培養(yǎng)液的OD600nm值。

1.3.7 pH值對生物胺降解菌株生長的影響

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液分別接入到pH分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值），以不接種菌的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對照，以O(shè)D600nm值評價(jià)菌株的耐酸能力[20]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次測定，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”（X±SD）表示，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有無生物胺合成活性乳酸菌的確認(rèn)

在不利于自身生長繁殖的環(huán)境（即酸度略高、營養(yǎng)匱乏等環(huán)境）下，為了維持自身生長繁殖，具有氨基酸脫羧酶活性的乳酸菌受脅迫機(jī)制調(diào)控將氨基酸脫羧形成相應(yīng)的生物胺（一種堿性物質(zhì)）來改善環(huán)境，從而有利于自身生長繁殖[21]。溴甲酚紫在酸性條件下顯示黃色，可初步判斷菌株不具有氨基酸脫羧酶活性即為不產(chǎn)生物胺的陰性菌株，在堿性條件下顯示紫色，可初步判斷菌株具有氨基酸脫羧酶活性即為產(chǎn)生物胺的陽性菌株[22]。根據(jù)液體培養(yǎng)基的顯色情況從41株乳酸菌株中初步篩選出了9株陰性菌株，分別為菌株2、4、10、21、27、28、29、30、40，其余32株菌株均為陽性菌株。

2.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)液的高效液相色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

圖1 3種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 3 biogenic amines standard

由圖1可知，3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）在高效液相色譜上出峰速度快，分離明顯，20 min內(nèi)全部出峰，分別為尸胺在7.1 min左右出峰，組胺在16.7 min左右出峰，酪胺在18.9 min作左右出峰，故此方法對分離檢測生物胺具有良好的效果。

表3 3種生物胺的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear regression equation and correlation coefficient of 3 biogenic amines

由表3可知，3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）的峰面積與其對應(yīng)質(zhì)量濃度分別呈現(xiàn)良好正相關(guān)的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.992 0，說明該方法能夠可靠的定量分析這3種生物胺。

2.3 生物胺降解菌株的篩選

在顯色實(shí)驗(yàn)初步篩選的基礎(chǔ)上，采用HPLC法定量檢測生物胺，從而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，對菌株降解生物胺的能力做出準(zhǔn)確的評價(jià)。根據(jù)9株陰性菌株的生物胺含量測定結(jié)果，計(jì)算出3種生物胺的降解率，結(jié)果見表4。

表4 9株乳酸菌菌株對生物胺的降解作用Table 4 Degradation of biogenic amines by 9 strains of lactic acid bacteria

由表4可知，9株陰性菌株降解生物胺的能力各不相同，且差異較大，其中菌株40（嗜酸乳桿菌）對組胺和酪胺無降解能力，有組胺和酪胺合成能力，說明菌株40產(chǎn)酸能力強(qiáng)于生物胺生成能力。菌株27（戊糖乳桿菌）對尸胺的降解能力最強(qiáng)，達(dá)到了63.11%；菌株2（發(fā)酵乳桿菌）對組胺的降解能力最強(qiáng)，達(dá)到了82.95%；菌株30（植物乳桿菌）對酪胺的降解能力最強(qiáng)，達(dá)到了89.97%。菌株2、4、27、28、30對3種生物胺的降解能力均＞50%，其中，菌株30（植物乳桿菌）對3種生物胺均有較好的降解能力，分別為62.42%（尸胺）、74.32%（組胺）、89.97%（酪胺），是一株較理想的高效生物胺降解菌株。生物胺測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一種屬不同菌株的乳酸菌，其生物胺降解能力不同，因此，其生物胺降解能力僅具有菌株特異性，而不具有種屬特異性[23]。故選取菌株2、4、27、28、30進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 生物胺降解菌株的耐鹽性能篩選

我國大部分發(fā)酵食品具有高鹽高滲透壓的環(huán)境，因此若想將生物胺降解菌株運(yùn)用于發(fā)酵食品中就需要菌株能夠適應(yīng)高鹽高滲透壓的環(huán)境[24]。對5株生物胺降解效果較好的菌株進(jìn)行耐鹽試驗(yàn)，測定其在不同鹽含量下的生長效率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，對于5株菌，其環(huán)境中的NaCl含量與生長情況呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)NaCl含量為7%時(shí)，菌株4和27幾乎不生長；當(dāng)NaCl含量為9%時(shí)，菌株2幾乎不生長；當(dāng)NaCl含量為11%時(shí)，菌株28、30仍有一定的耐鹽能力，生長效率分別為4.50%和4.31%。故選取菌株28、30進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 5株菌株在不同鹽含量下的生長效率Fig.2 Growth efficiency of 5 strains under different salt concentrations

2.5 pH值對生物胺降解菌株生長的影響

合適的pH值是乳酸菌正常生長代謝以及降解生物胺的必備條件[25]，因?yàn)橹挥性谝欢ǖ膒H環(huán)境下生物胺氧化酶才能夠有效的發(fā)揮作用，因此若想將生物胺降解菌株運(yùn)用于發(fā)酵食品中生長良好就需要探究菌株適宜的pH環(huán)境?？疾靝H值對2株優(yōu)良乳酸菌（菌株28、30）生長的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株28的最佳生長pH值為5.5～7.5，菌株30的最佳生長pH值為5.5～8.5；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，兩株菌仍具有良好的生長能力，菌株30的生長能力強(qiáng)于菌株28。因此，菌株30的耐酸性最好。

圖3 篩選菌株不同pH值下的生長情況Fig.3 Growth situation of selected strains in different pH conditions

3 結(jié)論

從41株乳酸菌中篩選得到5株高效降解生物胺的菌株，其中以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）30的生物胺降解能力最好，其對3種生物胺的降解率分別為74.32%（組胺）、89.97%（酪胺）、62.42%（尸胺），在含鹽量0～9%和pH值為4.5～8.5環(huán)境中能夠較好的生長繁殖。該菌株無生物胺生成活性，并同時(shí)具備生物胺降解能力和耐鹽耐酸能力，可以作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品生物胺降解備選菌株，用于提高傳統(tǒng)發(fā)酵食品安全性。