以黃酒為介質(zhì)的美拉德反應(yīng)香料制備及加香應(yīng)用研究

徐 達(dá)，李瑞麗，2 *，蘇加坤，郭 磊，周 艷，蔡繼寶

（1.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，江西南昌 330096；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；3.南昌丁坊酒業(yè)有限公司，江西南昌 330200）

黃酒是世界三大古酒之一，一般以大米、黍米為原料制作，酒精含量通常在10%vol～20%vol，內(nèi)含21種氨基酸，有中國“液體面包”的美譽。黃酒根據(jù)糖分的多少，可以分為4種類型，即甜型（＞100 g/L）、半甜型（15～40 g/L）、半干型（40～100 g/L）、干型（＜15 g/L）[1-2]。黃酒中的氨基酸賦予黃酒較高的營養(yǎng)價值，尤其是游離氨基酸的組成，是黃酒很多味道的重要來源，如甘氨酸、丙氨酸、組氨酸有甜味；谷氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸有鮮味；酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸有澀味[3-7]。

美拉德反應(yīng)廣泛存在于煙草調(diào)制、卷煙加工及消費過程中，能產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，具有增補煙香、醇化煙氣、降刺抑雜等作用[8-10]。近年來，有采用天然產(chǎn)物提取液（如紅棗提取液、甘薯水提物、南瓜水提物等）作為美拉德反應(yīng)介質(zhì)制備煙用香料[11-14]，用于改善卷煙的抽吸品質(zhì)，取得了較好的效果?？紤]到黃酒中氨基酸、糖類可作為美拉德反應(yīng)前體，且有機酸和酯類在降低卷煙雜氣、提升卷煙品質(zhì)方面具有一定的作用，本研究篩選了干型、半干型、甜型3種黃酒作為美拉德反應(yīng)介質(zhì)制備煙用香料，并完成了黃酒及黃酒介質(zhì)美拉德反應(yīng)香料的成分剖析和應(yīng)用評價，旨在為酒香型美拉德反應(yīng)香料的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干型黃酒（GH）、半干型黃酒（BGH）、甜型黃酒（TH）：南昌丁坊酒業(yè)有限公司；葡萄糖、脯氨酸（均為分析純）：上海藍(lán)季科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：美國J&T Baker公司；乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、庚酸、壬酸、癸酸、苯甲酸、月桂酸等（酸性成分標(biāo)準(zhǔn)品），4-環(huán)戊烯-1，3-二酮、2-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、2-乙酰基-5-甲基呋喃、苯甲醇、苯乙酮、愈創(chuàng)木酚、苯乙醇、2-甲氧基-4-甲基苯酚、香蘭素、β-二氫大馬酮等（中性成分標(biāo)準(zhǔn)品），吡啶、2-甲基吡啶、2-乙酰吡啶、3-甲基吡啶、3-乙酰吡啶、4-甲基吡啶、2-乙基吡啶、2,4-二甲基吡啶、2,5-二甲基吡啶、吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、喹啉、2,3-二甲基吲哚等（堿性成分標(biāo)準(zhǔn)品）（純度＞96%）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀：美國Agilent公司；CIJECTOR卷煙加香注射機：德國Burghart公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本Hitachi公司；ELX800型酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；PHS-3C精密pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA124S型電子天平（感量0.000 1 g）：北京賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酒美拉德反應(yīng)物的制備

選擇GH、BGH、TH三種黃酒為反應(yīng)介質(zhì)，在三口燒瓶中按照20∶5∶2（g∶g）的比例依次添加黃酒、葡萄糖、脯氨酸，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至9.0，安裝回流冷凝管和溫度計，油浴溫度控制在100 ℃，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速調(diào)為250 r/min，反應(yīng)1～4 h。待反應(yīng)液自然冷卻后，用棕色樣品瓶中避光保存。將以GH、BGH、TH三種黃酒為反應(yīng)介質(zhì)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分別標(biāo)記為GH-M、BGH-M、TH-M。

1.3.2 測定方法

游離氨基酸、酒精度含量：參照參考文獻(xiàn)[15]的方法。

氨基酸態(tài)氮、總糖、總酸含量：參考國標(biāo)GB/T 13662—2018《黃酒》的方法[1]。

美拉德反應(yīng)過程中吸光度值：反應(yīng)物樣品采用蒸餾水稀釋50倍后，冷卻至25 ℃時，在波長420 nm處測其吸光度值。

美拉德反應(yīng)物致香成分分析：準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.1 mg）樣品，加入40 mL二氯甲烷和100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩處理30 min，靜置分層，移取10 mL二氯甲烷層萃取液，過濾，在30 ℃、100 r/min、30 kPa條件下減壓蒸餾至約1.0 mL，經(jīng)0.45 μm有機相濾膜過濾，進(jìn)行GC-MS分析。

中性、酸性和堿性成分GC條件參考文獻(xiàn)[16]中的方法，采用選擇性離子檢測（selected ion monitor，SIM）和全掃描（full spectrum scan，SCAN）結(jié)合的掃描方式進(jìn)行分析。酸性成分和中性成分以乙酸苯乙酯（817 μg/mL）為內(nèi)標(biāo)，堿性成分以煙酸甲酯（804 μg/mL）為內(nèi)標(biāo)，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）08和Wiley譜庫檢索，根據(jù)保留時間定性后采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，或以匹配度高于85%定性后以相對校正因子為1進(jìn)行定量。

嗅香評價：以體積分?jǐn)?shù)50%的丙二醇為溶劑將GH-M、BGH-M、TH-M按5%的體積比稀釋后，按照YC/T 145.6—1998《煙用香精香氣質(zhì)量通用評定方法》[17]的方法組織7名專業(yè)評吸人員分別進(jìn)行描述性嗅香評價。

感官評價：利用香精注射機將GH-M、BGH-M、TH-M分別按煙絲質(zhì)量的0.05%的比例添加到某品牌卷煙中，加香樣品與參比樣品分別置于溫度（22±1）℃、相對濕度（60±2）%的恒溫恒濕環(huán)境中平衡48 h。參照YC/T 497—2014《卷煙中式卷煙風(fēng)格感官評價方法》[18]組織7名專業(yè)評吸人員對加香卷煙樣品的香氣質(zhì)量、刺激性、協(xié)調(diào)性進(jìn)行感官評價，指標(biāo)賦分參照鄭州煙草研究院單體/香精作用評價標(biāo)準(zhǔn)[19-20]，感官評價、香韻評分標(biāo)準(zhǔn)見表1和表2。

表1 卷煙感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of cigarette

表2 卷煙香韻評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Fragrance rating standard of cigarette

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃酒理化指標(biāo)的差異分析

三種黃酒（GH、BGH、TH）的酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮分析結(jié)果見表3。

表3 不同黃酒的酒精度、總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮含量Table 3 Contents of alcohol,total sugar,total acid and total amino acid nitrogen in different Huangjiu

由表3可知，總糖含量的區(qū)別是決定黃酒分類的主要因素，其中TH＞BGH＞GH，三者含量差異顯著；酒精度TH＞BGH＞GH，其中TH偏高的原因可能與甜型黃酒釀造過程中的白酒添加工藝有關(guān)；總酸TH＞BGH＞GH；氨基酸態(tài)氮BGH＞GH＞TH。由于釀造工藝的不同，三種黃酒中各種理化指標(biāo)均具有一定差異。

2.2 不同黃酒中游離氨基酸組成差異分析

三種黃酒中游離氨基酸的含量分析結(jié)果見表4。由表4可知，GH、BGH、TH中均檢出18種氨基酸，氨基酸總量BGH＞TH＞GH。其中，BGH天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸含量相對較高；TH谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸含量相對較高；GH谷氨酸、脯氨酸、精氨酸含量相對較高。

表4 干型黃酒、半干黃酒、甜型黃酒中的游離氨基酸含量Table 4 Contents of free amino acids in dry Huangjiu,semi-dry Huangjiu and sweet Huangjiu

2.3 不同黃酒美拉德反應(yīng)物的感官評價比較

黃酒美拉德反應(yīng)物的嗅香評價及用于卷煙中的感官評價結(jié)果見表5。

表5 不同黃酒美拉德反應(yīng)物的嗅香評價及感官評價結(jié)果Table 5 Aroma evaluation and sensory evaluation results of Maillard reaction products of different Huangjiu

由表5可知，三種不同黃酒美拉德反應(yīng)物進(jìn)行嗅香評價時均有烤香、發(fā)酵米香、酒香樣的特點。在卷煙增香方面TH-M、BGH-M增補甜香的作用明顯優(yōu)于GH-M，TH-M在卷煙中的增香作用整體優(yōu)于BGH-M、GH-M，這可能與黃酒中的有機酸總量、總糖含量、氨基酸含量和組成的差異有關(guān)。

在美拉德反應(yīng)過程中三種黃酒反應(yīng)物（GH-M、BGH-M、TH-M）的吸光度值（A420nm）值變化見圖1。由于吸光度值反映美拉德反應(yīng)褐變程度，美拉德反應(yīng)褐變程度越大，產(chǎn)生的香味物質(zhì)則越多，由圖1可知，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)速率和褐變程度TH＞BGH＞GH。究其原因可能與黃酒總酸含量有關(guān)，有機酸在反應(yīng)前形成了有機酸-有機酸鹽緩沖體系，TH反應(yīng)體系緩沖力較強，這有利于氨基化合物參與羰氨反應(yīng)生成美拉德特征香味物質(zhì)[20]。

圖1 美拉德反應(yīng)過程中三種反應(yīng)體系吸光度值的變化Fig.1 Absorbance values change of Maillard reaction system during the reaction

美拉德反應(yīng)后總酸含量變化見圖2。由圖2可知，TH-M（9.0 g/L）＞BGH-M（5.87 g/L）＞GH-M（4.62 g/L），有機酸含量較高的香料樣品有助于改善卷煙刺激；可能與黃酒總糖含量有關(guān)，由于還原糖含量和褐變程度成正比，還原糖含量更高的TH體系有利于美拉德香味物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)生。

圖2 3種黃酒反應(yīng)物在美拉德反應(yīng)前后的總酸含量變化Fig.2 Change of total acid content of three Huangjiu reactant before and after Maillard reaction

美拉德反應(yīng)后總糖含量變化見圖3。由圖3可知，TH-M（125.7 g/L）＞GH-M（113.0g/L）＞BGH-M（99.7 g/L），三種黃酒體系中的還原糖消耗量也印證上述結(jié)論。

圖3 3種黃酒反應(yīng)物在美拉德反應(yīng)前后的總糖含量變化Fig.3 Change of total sugar content of three Huangjiu reactant before and after Maillard reaction

氨基酸含量和組成差異也可能是造成三者感官差異的原因之一。不同的氨基酸和還原糖在美拉德反應(yīng)過程中能產(chǎn)生明顯不同的氣味物質(zhì)，盡管黃酒中氨基酸含量（1.94～2.61 g/L）相對于外源添加的脯氨酸量（約100 g/L）較少，但對于整體反應(yīng)物的香氣豐富性來說，依然能造成一定的影響。有研究表明，葡萄糖作為糖源時，脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在100 ℃的反應(yīng)產(chǎn)物具有烤面包香，丙氨酸、甘氨酸主要產(chǎn)生焦糖香氣，與煙香協(xié)調(diào)，能改善卷煙吸味；而精氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物類似烤糊的糖，亮氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物具有烤乳酪偏苦味。根據(jù)2.2的分析結(jié)果，TH中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸占比更高，使得其美拉德反應(yīng)物添加在卷煙中較之BGH、GH增香作用更明顯。

2.4 不同黃酒美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香味成分分析

表6 不同黃酒美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香味成分分析Table 6 Analysis of aroma components of Maillard reaction products of different Huangjiu

續(xù)表

由表6可知，GH-M、BGH-M、TH-M均含有豐富的酸性、中性及堿性香味成分，但特征組分有較大差異。TH-M中含有的有機酸含量相對較高，尤其是乙酸，TH-M含量遠(yuǎn)高于BGH-M、GH-M，有機酸可調(diào)節(jié)酸堿平衡，醇和煙氣，減少刺激性。TH黃酒體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的苯乙醇、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DDMP）含量遠(yuǎn)高于BGH-M、GH-M，其中，苯乙醇可賦予煙氣甜香、堅果香、辛香及花香，DDMP有增加口腔甜潤感、改善余味舒適性的作用。TH-M中的堿性香味成分總量高于BGH-M、GH-M，尤其是2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪表現(xiàn)更為明顯，其中，2-甲基吡嗪具有可可香、堅果香及烤香香氣，2,3-二甲基吡嗪具有堅果香、咖啡香和類黃油樣香氣。

2.5 不同黃酒美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主成分分析

圖4 不同黃酒美拉德反應(yīng)產(chǎn)物酸性（A）、中性（B）及堿性（C）風(fēng)味成分主成分分析結(jié)果Fig.4 Principal components analysis results of acidic (A),neutral(B)and alkaline(C) flavor compounds of Maillard reaction products of different Huangjiu

酸性成分，特別是揮發(fā)性酸性成分（丙酸、壬酸、己酸、甲基戊酸、辛酸、乙酸、丁酸）是影響卷煙煙氣特性的重要成分之一，可調(diào)節(jié)煙氣pH值，使煙氣醇和。酸性成分主成分分析結(jié)果見圖4A。由圖4A可知，在第二象限，與BGH-M相關(guān)性較高的酸性成分是S2（丙酸）、S10（壬酸）；在第三象限，與GH-M相關(guān)性較高的酸性成分是S7（己酸）、S6（3-甲基戊酸）、S14（月桂酸）、S12（4-甲基戊酸）；在第四象限，與TH-M相關(guān)性較高的酸性成分是S9（辛酸）、S1（乙酸）、S3（丁酸）。

中性成分和堿性成分中含有大量的美拉德反應(yīng)致香物質(zhì)，是影響卷煙香氣質(zhì)量的重要成分。中性成分主成分分析見圖4B。由圖4B可知，在第一象限，與TH-M相關(guān)性較高的中性成分是N8（愈創(chuàng)木酚）、N12（琥珀酸二乙酯）、N16（DDMP）、N18（金合歡基丙酮）、N4（乳酸乙酯）、N19（十六酸甲酯）、N17（異丁香酚）、N7（苯甲醇）、N13（香蘭素）、N5（5-甲基-2-糠醛），其中，DDMP對卷煙香氣質(zhì)、甜感的提升有顯著作用，十六酸甲酯醇和煙氣，苯甲醇有弱花香，香蘭素有甜香、奶香香氣，5-甲基-2-糠醛有甜香，可增加煙氣濃度；在第二象限，與GH-M相關(guān)性較高的中性成分是N15（香葉基丙酮），具有青香，可增加煙氣濃度；在第三象限，與BGH-M相關(guān)性較高的中性成分是N6（3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮），具有甜香。

堿性成分主成分分析見圖4C。由圖4C可知，在第一象限，與TH-M相關(guān)性較高的堿性成分是A3（2-甲基吡啶）、A4（2-甲基吡嗪）、A9（2,3-二甲基吡嗪）、A16（2-甲基吲哚）、A14（喹啉）、A6（2,6-二甲基吡嗪）、A17（2,3-二甲基吲哚）、A11（3-乙基-2,5-二甲基吡嗪）、A2（吡嗪），其中，吡嗪類物質(zhì)如2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪燈，具有可可、堅果、烤香香氣。在第二象限，與GH-M相關(guān)性較高的堿性成分是A1（吡啶）；在第三象限，與BGH-M相關(guān)性較高的堿性成分是A5（2,5-二甲基吡啶）、A13（2-乙酰吡啶），其中，2-乙酰吡啶具有爆米花、玉米樣香氣。

綜合圖4可知，在香氣質(zhì)量方面，能產(chǎn)生可可、堅果及烤香香味的物質(zhì)（A4、A9、A6、A11、A2）和能產(chǎn)生甜香的物質(zhì)（N16、N7、N13、N5）均與TH-M相關(guān)性較高，因此，TH-M在提升烤香、甜香方面的表現(xiàn)更為突出。由表6可知，GH-M、BGH-M雖也含有能提升烤香、甜香的物質(zhì)，但其含量明顯低于TH-M。在煙氣特性方面，TH-M、GH-M、BGH-M的特征組分存在較大差異，由于TH-M醇和煙氣的特征組分總量明顯高于GH-M、BGH-M，因此，TH-M在醇和煙氣方面的表現(xiàn)相對較優(yōu)，與前述的感官評價結(jié)果一致。

3 結(jié)論

三種黃酒的總糖、酒精度、總酸指標(biāo)值均表現(xiàn)為TH＞BGH＞GH，尤其是總糖含量，TH遠(yuǎn)高于BGH、GH；氨基酸態(tài)氮指標(biāo)值表現(xiàn)為BGH＞GH＞TH。TH、GH、BGH中均檢出18種氨基酸，氨基酸總量表現(xiàn)為BGH＞TH＞GH。在黃酒介質(zhì)中添加葡萄糖和脯氨酸，進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備香料，不同黃酒體系美拉德反應(yīng)中，隨反應(yīng)時間延長，TH體系反應(yīng)速率和褐變程度均高于BGH和GH，可能與反應(yīng)前形成了有機酸-有機酸鹽緩沖體系有關(guān)。除此之外，也與TH體系反應(yīng)過程中糖消耗量較高及氨基酸特征組分有一定關(guān)系。反應(yīng)體系組成差異可能是造成不同黃酒美拉德反應(yīng)體系香味物質(zhì)種類及含量差異的原因。

TH-M用于卷煙加料的感官評價結(jié)果明顯優(yōu)于BGH-M、GH-M。不同黃酒美拉德反應(yīng)產(chǎn)物GH-M、BGH-M、TH-M中均含有大量致香物質(zhì)，TH-M的酸性、中性及堿性香味成分含量相對更為豐富。產(chǎn)生可可、堅果及烤香香味的物質(zhì)（2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、吡嗪燈）和能產(chǎn)生甜香的物質(zhì)（DDMP、香蘭素N7、5-甲基-2-糠醛等）均與TH-M相關(guān)性較高，因此，TH-M在提升烤香、甜香方面的表現(xiàn)更為突出。在調(diào)節(jié)酸堿平衡、醇和煙氣的酸性成分中，TH-M、GH-M、BGH-M酸性特征組分存在較大差異，且TH-M中酸性成分總量明顯高于GH-M、BGH-M，使得TH-M在煙氣特性方面的表現(xiàn)相對較優(yōu)。