尿酸氧化酶高產(chǎn)菌篩選與酶學(xué)性質(zhì)的研究

林鏗淳，鄧毛程*，李 靜，黃懷興，黃偉忠，黃潔華，張曉濤，方偉娜

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300）

尿酸形成于嘌呤分解途徑中最后一步反應(yīng)，是由黃嘌呤氧化還原酶催化黃嘌呤所生成的產(chǎn)物[1]。人體缺少尿酸氧化酶，不能將尿酸進(jìn)一步分解為較易溶解的尿囊素，為了維持體內(nèi)尿酸的正常水平，約有2/3的尿酸只能通過(guò)尿液排出體外[2-3]。如果尿酸生成量與排泄量失衡，會(huì)導(dǎo)致血清尿酸水平升高，將引發(fā)高尿酸血癥及其并發(fā)的痛風(fēng)、心血管疾病、腎臟疾病等疾病[4]。調(diào)查結(jié)果表明，全球高尿酸血癥的患病率逐年上升，已達(dá)到較高比例，中國(guó)和美國(guó)于2017年的高尿酸血癥患病率分別達(dá)到9.32%和10.32%[5]。目前，高尿酸血癥的臨床治療方法主要有：通過(guò)藥物抑制黃嘌呤氧化還原酶，以減少尿酸生成量；或者通過(guò)藥物促進(jìn)尿酸排泄量而降低尿酸積累量[6]。由于較多的高尿酸血癥治療藥物都具有不同程度的毒副作用，如引起腸胃不適、過(guò)敏、腎衰竭等不良反應(yīng)[7]，安全的、有效的高尿酸血癥防控方法必將是該領(lǐng)域的重要研究方向[8-9]。

控制外源性嘌呤攝入和進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)是防控高尿酸血癥的提倡方法[4，6]，但禁忌食用富含嘌呤食物通常給高尿酸血癥患者帶來(lái)諸多不便。近年來(lái)，為了降低一些食物的嘌呤含量，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)采用吸附法、超聲波處理法、外加酶法和微生態(tài)法等進(jìn)行去除嘌呤的研究，其中，外加酶法和微生態(tài)法初步顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[10]。尿酸氧化酶是外加酶法和微生態(tài)法去除尿酸的關(guān)鍵酶，它能夠催化尿酸分解代謝的起始反應(yīng)，即催化尿酸氧化為尿囊素和過(guò)氧化氫[11]。迄今為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃曲霉（Aspergillus flavus）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、微桿菌屬（Microbacteriumsp.）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、苛求芽孢桿菌（Bacillus fastidiosus）、彭氏變形桿菌（Proteus penneri）等微生物能夠產(chǎn)生尿酸氧化酶[12-13]。但是，發(fā)酵產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差等仍是尿酸氧化酶生產(chǎn)的主要問(wèn)題，導(dǎo)致了價(jià)格昂貴，并限制其應(yīng)用[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬篩選尿酸氧化酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)尿酸氧化酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，期望為尿酸氧化酶發(fā)酵研究提供菌種資源及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

普洱茶：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

尿酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：美國(guó)Sigma公司；尿酸氧化酶（10 U/mg）、過(guò)氧化物酶（150 U/mg）、4-氨基安替比林、尿酸、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；Lowry法穩(wěn)定性蛋白濃度測(cè)定試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物和基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：上海生工生物工程股份有限公司；Sephadex G-100：上海弘順生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馴化培養(yǎng)基：尿酸10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42.5 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0。在馴化培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂，即可制得平板分離培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0。

富集培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0。

尿酸發(fā)酵培養(yǎng)基：尿酸10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5g/L，KH2PO42g/L，調(diào)節(jié)pH7.0。上述培養(yǎng)基都經(jīng)121℃滅菌20min，冷卻后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-C2112F雙層可編程恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；ABI9700型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Biometra公司；S-3000N掃描電鏡：日本日立公司；Biotek Synergy H1多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；低壓層析系統(tǒng)（配置QT98探索者紫外檢測(cè)儀，N2000工作站）：上海琪特分析儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；H1850R高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離及篩選

將10 g普洱茶接入100 mL馴化培養(yǎng)基，于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，吸取10 mL培養(yǎng)液體轉(zhuǎn)接到100 mL馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，如此轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。最后，將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板培養(yǎng)基上，置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察平板上菌落周圍是否有透明圈，挑取呈現(xiàn)較大透明圈的菌落，接入斜面培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，置于4 ℃冰箱保藏。

將各斜面菌種接入100 mL富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)16 h，于4 ℃、8 000 r/min的條件下離心收集菌體，用無(wú)菌水洗滌菌體2次。將菌體加入100mL尿酸發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，經(jīng)無(wú)菌水洗滌3次，用硼酸鈉溶液（pH 8.0、0.1 mol/L）制成菌懸液，用超聲波破碎法制備粗酶液，測(cè)定粗酶液的酶活，優(yōu)選酶活最高的菌株。

1.3.2 菌種鑒定

利用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)，然后參照文獻(xiàn)[15]所述方法，采用試劑盒提取菌體DNA，利用18S rDNA通用引物NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和NS8（TCCGCAGGTTCACCTACGGA）PCR擴(kuò)增DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行測(cè)序。然后，以基本局部比對(duì)搜索工具（basic localalignment search tool，BLAST）方式，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，再利用軟件MEGA7.0將比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 粗酶液制備

參照文獻(xiàn)[12]所述方法，將培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，收集菌體，經(jīng)無(wú)菌水洗滌3次，加入20 mL硼酸鈉溶液（pH 8.0、0.1 mol/L）制成菌懸液，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎。超聲波破碎條件為：超聲功率150 W，總時(shí)間為12 min，每次破碎5 s，間歇10 s。破碎后的懸液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，獲得上清液，即為粗酶液。測(cè)定粗酶液酶活和蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）尿酸氧化酶酶活測(cè)定

按照文獻(xiàn)[13]中方法，稍有改進(jìn)。在具刻度比色管中，依次加入0.5 mL尿酸溶液（10 mmol/L）、0.25 mL 4-氨基安替比林溶液（60 mmol/L）、0.25 mL苯酚溶液（20 g/L）、0.5 mL待測(cè)酶液和0.5 mL過(guò)氧化物氧化酶（200 U/L），置于30 ℃水浴中反應(yīng)10 min，加入2.5 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，用水定容至5 mL，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值。以硼酸鈉溶液（pH8.0、0.1 mol/L）代替待測(cè)酶液，所構(gòu)成的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。在酶活測(cè)定前，配制尿酸氧化酶酶液（200 U/L），利用尿酸標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法測(cè)定尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后的吸光度值，建立尿酸溶液濃度（x）與吸光度值（y）的尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.045 2x-0.028 3，R2=0.999 6。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品溶液中尿酸氧化酶酶活。

尿酸氧化酶酶活定義為：在30 ℃、pH 8.0的條件下，每分鐘催化1 μmol尿酸生成H2O2所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

（2）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Lowry法[14]。配制系列質(zhì)量濃度的牛血清蛋白溶液，在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)定吸光度值，以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.052 1x-0.053 5，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 5。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算酶液中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 尿酸氧化酶的分離純化

參照文獻(xiàn)[16]的硫酸銨分級(jí)沉淀方法，將硫酸銨加入粗酶液，依次使硫酸銨飽和度達(dá)到20%、40%、60%、80%，于4 ℃條件下靜置12 h，離心收集硫酸銨飽和度80%下的蛋白沉淀。用超純水溶解蛋白沉淀，放入截留分子質(zhì)量為10 kDa透析袋，置于4 ℃冰箱中進(jìn)行透析，再用10 kDa超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮。利用裝有Sephadex G-100凝膠柱（1.2 cm×50 cm）的蛋白質(zhì)對(duì)超濾濃縮酶液進(jìn)行層析分離，上樣量為3 mL，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5）洗脫，洗脫液流速為0.3 mL/min，以1 mL為1管，分管收集波長(zhǎng)280 nm處有吸收峰的流分。測(cè)定超濾濃縮液、各流分的酶活和蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

采用SDS-PAGE電泳鑒定純化后的酶液，按SDS-PAGE試劑盒使用方法，采用12%分離凝膠和5%濃縮凝膠，30 mA恒流電泳2.5 h。電泳后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.3.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

將經(jīng)透析、超濾分離所得的酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，調(diào)節(jié)酶活測(cè)定反應(yīng)體系的pH，分別在不同pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）條件下測(cè)定酶活；分別在不同溫度（24 ℃、26℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）條件下測(cè)定酶活；分別在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中加入不同金屬離子（Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+），在8 mmol/L金屬離子的條件下測(cè)定酶活。分別以溫度影響實(shí)驗(yàn)中的最高酶活、pH影響實(shí)驗(yàn)中的最高酶活、不添加金屬離子體系的酶活作為對(duì)照，計(jì)算各類實(shí)驗(yàn)的相對(duì)酶活，其計(jì)算方法為：相對(duì)酶活=（特定條件下的酶活/對(duì)照條件的酶活）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

如圖1所示，具有尿酸代謝能力的微生物能夠在尿酸平板培養(yǎng)基呈現(xiàn)透明圈。挑取46個(gè)透明圈較大的菌落，經(jīng)搖瓶發(fā)酵、粗酶活測(cè)定，以及換算為發(fā)酵液中酶活含量，46個(gè)菌株的酶活分布范圍為2.3～10.8 U/mL，其中菌株UR-05的酶活最高。菌株UR-05的菌落呈白色，圓形飽滿，中間凸起，表面粗糙。電子掃描顯微鏡（scanning electronic microscopy，SEM）下的菌體形態(tài)如圖2所示，菌株具有酵母的一般形態(tài)特征，菌體呈橢圓型，有芽體[17-18]。

圖1 平板篩選的透明圈Fig.1 Transparent zone of plate screening

圖2 菌株UR-05的電子顯微鏡掃描結(jié)果Fig.2 Scanning electron microscope result of strain UR-05

菌株UR-05的18S rDNA經(jīng)擴(kuò)增、純化、測(cè)序后，獲得1 685 bp的DNA序列，將DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3所示。由圖3可知，菌株UR-05與序列編號(hào)AB000659的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母的相似度達(dá)到99%，故鑒定菌株UR-05為食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）。

圖3 基于18S rDNA基因序列菌株UR-05的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain UR-05 based on 18S rDNA gene sequences

最早從土壤中分離得到的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母被描述為食嘌呤絲孢酵母（Trichosporon adeninovorans）[19]，后經(jīng)基因分析，Blastobotrys屬、Arxula屬和Sympodiomyces屬的微生物應(yīng)歸為Blastobotrys屬[20]。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母是一種非傳統(tǒng)的不完全單倍體酵母，被研究人員關(guān)注相對(duì)較少，主要出現(xiàn)在普洱茶發(fā)酵真菌群落的相關(guān)報(bào)道中[21-24]。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母能夠以腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、尿酸、6,8-二羥嘌呤等作為唯一的碳源和氮源[20]，但是，關(guān)于食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母尿酸氧化酶的研究報(bào)道極少，因而有必要進(jìn)一步對(duì)菌株UR-05所產(chǎn)尿酸氧化酶進(jìn)行研究。

2.2 尿酸氧化酶的純化與分析

利用Sephadex G-100凝膠柱對(duì)超濾濃縮酶液進(jìn)行分離，獲得純化的尿酸氧化酶洗脫液。分離過(guò)程的酶活、蛋白含量與比酶活的測(cè)定結(jié)果如表1所示，純化后的比酶活為215.4 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到11倍。如圖4所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳，尿酸氧化酶顯示為單一條帶，分子質(zhì)量約為41.5 kDa。與文獻(xiàn)所報(bào)道的尿酸氧化酶相比，其分子質(zhì)量比較接近于絲光綠蠅（Luciliasericata）尿酸氧化酶的分子質(zhì)量（40.5 kDa）[25]，而大于苛求芽孢桿菌尿酸氧化酶（33 kDa）、產(chǎn)朊假絲酵母尿酸氧化酶（34 kDa）、黃曲霉尿酸氧化酶（35 kDa）等的分子質(zhì)量[26-28]。

表1 尿酸氧化酶純化的結(jié)果Table 1 Results of urate oxidase purification

圖4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Result of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

2.3 尿酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)

由圖5A可知，本實(shí)驗(yàn)所得尿酸氧化酶的最適酶促反應(yīng)pH為8.0，與來(lái)源于苛求芽孢桿菌、絲光綠蠅的尿酸氧化酶基本一致[12，25]。由圖5B可知，本實(shí)驗(yàn)所得尿酸氧化酶的最適酶促反應(yīng)溫度是30 ℃，來(lái)源于其他食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、產(chǎn)朊假絲酵母的尿酸氧化酶，文獻(xiàn)報(bào)道有40 ℃、37 ℃等不同最適酶促反應(yīng)的溫度[26，28]，但與其他來(lái)源的尿酸氧化酶存在一定差別。由圖5C可知，不同金屬離子對(duì)尿酸氧化酶活性均有不同程度的影響。Mg2+和Na+對(duì)該酶有激活作用，其中Mg2+的激活作用較明顯；K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+等離子對(duì)該酶具有抑制作用，其中Zn2+能夠強(qiáng)烈抑制該酶，這個(gè)現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道的苛求芽孢桿菌尿酸氧化酶性質(zhì)相似[12]。

圖5 pH值（A）、溫度（B）及金屬離子（C）對(duì)尿酸氧化酶酶活的影響Fig.5 Effect of pH value (A),temperature (B) and metal ion (C) on urate oxidase activity

3 結(jié)論

從普洱茶中篩選獲得1株高產(chǎn)尿酸氧化酶的菌株UR-05，經(jīng)形態(tài)特征和18S rDNA序列鑒定，確定該菌株是食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）。對(duì)尿酸氧化酶進(jìn)行分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析，確定該酶的分子質(zhì)量約為41.5 kDa，比酶活為215.4 U/mg，最適酶促反應(yīng)pH和溫度分別為8.0和30 ℃，在Mg2+和Na+存在的條件下顯現(xiàn)激活作用，在K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+存在的條件下顯現(xiàn)抑制作用。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母UR-05產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，所產(chǎn)尿酸氧化酶在一定條件范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，具有進(jìn)一步研究及應(yīng)用的價(jià)值。