鮮食葡萄來源酵母菌的鑒定及其釀造學特性分析

劉曉柱，李銀鳳，張遠林，曾 爽，張 松，黃名正

（貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州貴陽 550003）

葡萄酒的發(fā)酵本質(zhì)上是酵母菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精及其他代謝產(chǎn)物的過程[1]。由于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵性能強，酒精耐受性高，易于控制[2]，因此生產(chǎn)者多采用商業(yè)化的純種S.cerevisiae進行葡萄酒的生產(chǎn)，但酒體的風味特性、典型性以及豐富性通常不如采用非釀酒酵母生產(chǎn)的葡萄酒[3]。因此，隨著人們對非釀酒酵母認識的不斷加深，將各類非釀酒酵母用于酒類的生產(chǎn)逐漸成為一種普遍接受的方法[4-6]。但一般非釀酒酵母對乙醇較為敏感，因此多采用混合接種的方式（包括共同接種、順序接種兩種形式），既保證了發(fā)酵的順利進行，又保留了非釀酒酵母的釀造特性[7-9]。

克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）是一種普遍存在于各類水果上非釀酒酵母，某些P.kluyveri在產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等花香和水果香酯類物質(zhì)方面具有較大的優(yōu)勢[10]。研究發(fā)現(xiàn)，P.kluyveri與S.cerevisiae混合發(fā)酵可顯著增加葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量[11]；采用P.kluyveri生產(chǎn)的蘋果酒，具有更強的熱帶水果典型風味[12]；LU Y Y等[13]探討了接種P.kluyveri對榴蓮果酒的影響，結(jié)果表明，混合接種、順序接種P.kluyveri發(fā)酵的榴蓮果酒乙酸乙酯、乙酸異戊酯的含量增加，復(fù)合香氣物質(zhì)更加豐富。除此之外，P.kluyveri與S.cerevisiae混合發(fā)酵，還可以顯著提高白蘇維濃中揮發(fā)性果香硫醇的含量[14]；P.kluyveri與S.cerevisiae相比，能產(chǎn)生更多的酒精和乳酸乙酯[15]。另外，某些P.kluyveri菌株還能夠分泌一些毒性因子，可抑制葡萄酒生產(chǎn)中一些腐敗酵母[16]。因而，P.kluyveri在葡萄酒生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用潛能。但與其他類非釀酒酵母相比，目前，對P.kluyveri的研究還比較少，且主要來源于釀酒葡萄品種，對來源于鮮食葡萄來源的P.kluyveri釀造學特性研究更少。

因此，本研究采用形態(tài)觀察及分子生物學技術(shù)對鮮食葡萄來源菌株YM7進行菌種鑒定，并以商業(yè)化S.cerevisiaeX16為對照，從糖發(fā)酵性能、生長特性、糖耐受性、酒精耐受性、二氧化硫耐受性、酸耐受性以及β-葡萄糖苷酶、硫化氫生產(chǎn)能力等方面對其釀造學特性進行深入分析；繼而將其與S.cerevisiaeX16混合發(fā)酵葡萄汁，分析其對葡萄酒基本理化指標和香氣特性的影響，以期為葡萄酒生產(chǎn)提供潛在的優(yōu)質(zhì)酵母菌株，對改善葡萄酒品質(zhì)特性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株YM7：分離自陽光玫瑰（Shine Muscat）葡萄，保存于本實驗室；商業(yè)化的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）X16：法國LAFFORT公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[17]：酵母浸粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，瓊脂20 g，儲存液A（KH2PO413.75 g/L，KCl 10.625 g/L，CaCl23.125 g/L，MgSO4·7H2O 3.125 g/L）40 mL，儲存液B（FeCl32.5 g/L，MnSO42.5 g/L）1 mL，儲存液C（0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL無菌蒸餾水和10 mL體積分數(shù)95%乙醇中）1 mL，定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[17]：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。固體培養(yǎng)基另加入20 g瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix：生工生物工程（上海）股份有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：上海源葉生物公司；所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UH5300紫外分光光度計：日本日立公司；PHSJ-3F pH儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；SZM體視顯微鏡：中國寧波舜禹儀器有限公司；T100 PCR儀：美國伯樂公司；GCMS-TQ8040 NX氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographmass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株YM7的鑒定

形態(tài)觀察：將菌株YM7劃線于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)72 h，記錄菌落顏色、形態(tài)、光澤等特征，并拍照。采用結(jié)晶紫對菌株YM7進行染色，光學顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)，并拍照。

分子生物學鑒定：參考HOLM C等[18]方法提取菌株YM7的DNA作為模板，以通用引物NL1和NL4對菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將合格的PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源序列搜索比對。選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列，采用MEGA X軟件中的鄰接（neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株YM7的釀造學特性分析

（1）生長曲線測定

將供試菌株YM7與釀酒酵母X16分別以終濃度為108CFU/mL的接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，平行重復(fù)3次，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。共計取樣10次，取樣時間40 h。以各培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

（2）糖發(fā)酵試驗

將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量分別接種于含2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖的0.6%的酵母浸粉溶液中，酵母浸粉溶液置于含杜氏小管的試管中，以菌株X16為對照組，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察杜氏小管頂部是否有氣泡。若有氣泡產(chǎn)生，記為“+”（陽性反應(yīng)），反之，則記為“-”（陰性反應(yīng)）。

（3）生理耐受性測定

葡萄糖耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含葡萄糖質(zhì)量濃度分別為100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

酒精耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含酒精體積分數(shù)分別為3%、6%、9%、12%、15%的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

SO2耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含SO2質(zhì)量濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

酸耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量分別接種于含不同檸檬酸質(zhì)量濃度（15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

（4）β-葡萄糖苷酶酶活測定

采用p-NPG法分析供試菌株YM7產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力[16]。酶活力單位定義：在40 ℃、pH 5.0條件下，1 min水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol p-NP所需酶量為一個酶活力單位，U/mL。

（5）硫化氫測定

取10 μL菌體濃度為108CFU/mL的供試菌株YM7的菌液滴加至亞硫酸鉍培養(yǎng)基表面的無菌濾紙片上，液體完全吸收后，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，觀察濾紙片變色情況。以菌株X16為對照組，菌株產(chǎn)硫化氫能力由高到低，顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色[19]。

1.3.3 葡萄酒的制備[20]

取新鮮的北紅葡萄汁（帶皮壓榨），加入50 mg/L的SO2和600 mg/L的二甲基二碳酸鹽過夜滅菌處理，加入白砂糖調(diào)整糖度至24°Bx，并分成兩組，置于2 L無菌三角瓶中，每組平行重復(fù)3次。第一組（釀酒酵母組）：接種107CFU/mL的菌株X16；第二組（混合發(fā)酵組）：同時接種108CFU/mL的菌株YM7和107CFU/mL的菌株X16，26 ℃靜置發(fā)酵。

1.3.4 葡萄酒指標的測定

（1）理化指標的測定

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定葡萄酒酒精度、總酸及揮發(fā)酸含量。采用優(yōu)化的蒽酮法[21]測定葡萄酒總糖含量。

（2）香氣成分測定[22]

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS法測定葡萄酒中的香氣成分。美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.L標準譜庫檢索并匹配GC-MS采集得到的數(shù)據(jù)，進行定性分析。以環(huán)己酮（273.5 mg/L）為內(nèi)標物，采用內(nèi)標法進行香氣物質(zhì)的定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行整理和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準差”表示。Adobe Photoshop CS輔助作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株YM7的鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察

菌株YM7的菌落及細胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株YM7在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈黃白色，平鋪，邊緣不整齊，有褶皺，不透明；細胞近似橢圓狀、出芽生殖。根據(jù)菌落形態(tài)與細胞形態(tài)，初步鑒定菌株YM7為畢赤酵母屬[23]。

圖1 菌株YM7的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain YM7

2.1.2 分子生物學鑒定

基于26S rDNA基因序列構(gòu)建菌株YM7的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株YM7與畢赤酵母（Pichia kluyveri）菌株JE-22（JQ771710.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，鑒定菌株YM7為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列菌株YM7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YM7 based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

2.2 菌株YM7的釀造學特性

2.2.1 菌株YM7的生長曲線

菌株YM7的生長曲線見圖3。由圖3可知，菌株YM7的遲滯期為0～4 h，對數(shù)生長期為4～8 h，8 h后進入穩(wěn)定期，遲滯期、對數(shù)生長期與菌株X16的基本一致。在穩(wěn)定期的20 h以后，菌體濃度略低于菌株X16。因而，菌株YM7與商業(yè)化菌株S.cerevisiaeX16的生長性能較為相似。

圖3 菌株X16與菌株YM7的生長曲線Fig.3 Growth curves of strains X16 and YM7

2.2.2 菌株YM7的糖代謝能力

糖代謝實驗結(jié)果表明，菌株YM7可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖進行發(fā)酵。

2.2.3 菌株YM7的生理耐受性

菌株YM7的生理耐受性實驗結(jié)果見圖4。

圖4 菌株X16與YM7的生理耐受性實驗結(jié)果Fig.4 Results of physiological tolerances tests of strains X16 and YM7

由圖4可知，菌株YM7可耐受300 g/L的葡萄糖，但菌體OD600nm值隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加有降低的趨勢，且在各種葡萄糖質(zhì)量濃度下，菌體OD600nm值均低于菌株X16；菌株YM7可耐受體積分數(shù)3%的乙醇，當乙醇體積分數(shù)為6%時，菌體OD600nm值迅速降低，當乙醇體積分數(shù)達到9%，菌體無法生長，在各種乙醇體積分數(shù)條件下菌體OD600nm值均低于菌株X16；菌株YM7二氧化硫耐受性與檸檬酸耐受性與X16較為相似，差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 菌株YM7產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力

采用p-NPG顯色法分析了菌株YM7的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株YM7的胞外酶活及胞內(nèi)酶活均顯著低于菌株X16（P＜0.01），細胞壁酶活與菌株X16無顯著差異（P＞0.05）。

表1 菌株X16及YM7的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力測定結(jié)果Table 1 Determination results of β-glucosidase production ability of strains X16 and YM7

2.2.5 菌株YM7產(chǎn)硫化氫能力

菌株YM7的硫化氫產(chǎn)生能力見圖5。由圖5可知，菌株YM7的濾紙片呈棕黑色，且顏色比菌株X16深，因此，說明菌株YM7產(chǎn)硫化氫的能力高于菌株X16。硫化氫是一種具有臭雞蛋味的氣體，對酒體具有不良的影響[19]。菌株YM7產(chǎn)硫化氫量高于商業(yè)化S.cerevisiaeX16，因而后期可結(jié)合各種育種技術(shù)，對該菌株進行改造，使其控制在一定的范圍。

圖5 菌株X16及YM7硫化氫產(chǎn)生能力測定結(jié)果Fig.5 Determination results of hydrogen sulfide production ability of strains X16 and YM7

2.3 葡萄酒檢測分析結(jié)果

2.3.1 理化指標分析

兩組葡萄酒的基本理化指標見表2。由表2可知，兩組處理均完成了乙醇發(fā)酵，殘?zhí)橇烤?g/L，酒精度為12.16%vol～12.45%vol。與釀酒酵母組酒樣相比，混合發(fā)酵組酒樣中總酸含量升高，揮發(fā)酸含量降低，分別為6.17 g/L、0.29 g/L，說明菌株YM7可調(diào)節(jié)葡萄酒中酸類物質(zhì)含量，包括總酸和揮發(fā)酸。

表2 葡萄酒基本理化指標測定結(jié)果Table 2 Determination results of basic physical and chemical indicators of wine

2.3.2 香氣特性分析

由圖6可知，從兩組酒樣中檢測到酸類、醇類、酯類及其他類物質(zhì)，兩組酒樣其他類物質(zhì)含量無顯著性差異（P＞0.05）；混合發(fā)酵組酒樣揮發(fā)性醇類物質(zhì)為127.35 mg/L、酸類物質(zhì)含量為2.78 mg/L，均低于釀酒酵母組酒樣（137 mg/L、3.45 mg/L），揮發(fā)性酯類物質(zhì)含量（75.87 mg/L）高于釀酒酵母組（64.35 mg/L）。

圖6 兩組葡萄糖酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量測定結(jié)果Fig.6 Determination results of volatile aroma compounds contents in two groups of wine samples

非釀酒酵母是一大類除釀酒酵母之外的多種酵母類群總稱，由于其最初是從腐敗的葡萄中分離得到的，因而一直被認為污染菌，未受到重視[24]。隨著人們對非釀酒酵母菌認識的不斷加深，發(fā)現(xiàn)某些非釀酒酵母菌可產(chǎn)生較多的風味物質(zhì)，有助于增加酒體風味物質(zhì)的豐富性和復(fù)雜性，對葡萄酒的品質(zhì)具有積極作用。越來越多的非釀酒酵母被用于多種酒類的生產(chǎn)，且某些菌株已商業(yè)化[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)來源于鮮食葡萄的一株克魯維畢赤酵母YM7，可調(diào)節(jié)葡萄酒酸類物質(zhì)和揮發(fā)性香氣物質(zhì)品質(zhì)特性，因而在葡萄酒生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

本研究鑒定并深入分析了一株鮮食葡萄來源酵母菌株的釀造學特性，結(jié)果表明，菌株YM7為一株畢赤酵母（Pichia kluyveri），其生長特性、二氧化硫耐受性以及檸檬酸耐受性和商業(yè)化的S.cerevisiaeX16性能接近，葡萄糖耐受性低于菌株X16。該菌株對乙醇敏感，僅可耐受體積分數(shù)3%的乙醇，β-葡萄糖苷酶和硫化氫生產(chǎn)能力分別低于、高于菌株X16。此外，與S.cerevisiaeX16單獨發(fā)酵葡萄酒相比，葡萄酒揮發(fā)酸含量，香氣化合物中酸類、醇類物質(zhì)含量均降低，酯類物質(zhì)含量增加。綜上，Pichia kluyveriYM7具有良好生長特性、耐受性和發(fā)酵特性等釀造學特性，初步判斷為一株優(yōu)良葡萄酒釀造菌株，具有一定的潛在應(yīng)用價值。