耐酸砷還原菌Bacillus sp.strain P3-23的分離鑒定及其對高砷土壤砷釋放影響

劉紫薇，祝賢彬，馮紀(jì)龍，石晚霞

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078；2.長江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430100)

砷(As)是一種有毒元素，廣泛存在于自然環(huán)境中，天然活動和人為活動都會導(dǎo)致砷向危害人類健康與正常生活的方向歸趨。土壤砷污染、水體砷污染和大氣砷污染等嚴(yán)重環(huán)境安全問題已引起世界各國的關(guān)注。土壤中的砷可通過粉塵或者煙霧進(jìn)入到大氣中，并可通過地表徑流或滲漏作用進(jìn)入水體中。砷污染水體體系中，砷污染地下水對人類的影響直接且顯著，直接飲用地下水或使用高砷地下水灌溉農(nóng)田導(dǎo)致人類砷中毒的現(xiàn)象已屢見不鮮。

砷污染地下水分布于世界各地，情況尤為嚴(yán)重的國家和地區(qū)有阿根廷、孟加拉、智利、中國大陸地區(qū)、中國臺灣地區(qū)、印度孟加拉州、墨西哥中部、羅馬尼亞和越南等，地下水砷污染已成為人類共同面臨的嚴(yán)重環(huán)境污染問題。含砷鐵(氫)氧化物礦物的還原性溶解被認(rèn)為是原生高砷地下水形成的主要機(jī)制，一方面鐵還原菌還原三價(jià)鐵的同時(shí)使礦物溶解，釋放出吸附于礦物表面的砷；另一方面在砷還原微生物作用下，吸附性更高的As被還原為遷移性更強(qiáng)的As，導(dǎo)致砷在水體中遷移與富集，微生物在此過程中起關(guān)鍵作用。因此，全面認(rèn)識砷污染地下水的形成機(jī)制對砷污染地下水的時(shí)空分布預(yù)測與精準(zhǔn)治理是至關(guān)重要的，故集中研究砷循環(huán)相關(guān)微生物是必要的，其作用規(guī)律對揭示砷的遷移與轉(zhuǎn)化規(guī)律有重要意義，可為砷污染的發(fā)展趨勢預(yù)測與防治提供科學(xué)依據(jù)。

砷還原菌是砷生物地球化學(xué)循環(huán)中最主要的微生物之一。許多學(xué)者分離出砷還原菌單菌，實(shí)驗(yàn)證明其可以直接參與吸附態(tài)砷的溶解與釋放，在砷污染地下水形成過程中對砷的遷移與轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用。砷還原微生物的功能特性如今研究得較為透徹，不少研究關(guān)注到環(huán)境因素對于砷還原微生物作用的影響。Blum等分離出一株耐高鹽砷還原菌，表明砷還原菌可存在于極端環(huán)境中，對環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，也預(yù)示著地球以外生境微生物存在的可能性。

本實(shí)驗(yàn)從石門雄黃尾礦高砷土壤中分離得到一株耐酸砷還原菌，通過分子生物學(xué)和微生物學(xué)手段對其進(jìn)行系統(tǒng)分類和生理生化特性鑒定，并使用微生物學(xué)方法在不同溫度、pH值和電子供體條件下進(jìn)行培養(yǎng)，探究其對環(huán)境因素波動的適應(yīng)能力，檢測菌株對高砷土壤砷釋放作用的影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對人們認(rèn)識砷還原微生物生物學(xué)特征和生理習(xí)性有幫助，極端環(huán)境中也可預(yù)測其存在的可能性，這將有助于更加深入探索砷污染地下水的形成機(jī)制，同時(shí)完善砷的生物地球化學(xué)循環(huán)模式。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集與檢測

砷污染土壤樣品采自于湖南省常德市石門縣雄黃礦區(qū)(北緯29.7°，東經(jīng)111.0°)，采集大約地面下5～6 cm處土壤，并置于事先滅菌的50.0 mL離心管中，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于冰箱中4℃保存。

土壤樣品用王水煮沸消解2 h后取上清液使用原子熒光光譜儀檢測總砷含量。取新鮮土壤樣品平鋪于干凈的稱量紙上，放置于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，研磨后過2 mm篩，并稱取處理后樣品2 g，放入10 mL離心管中，加入5 mL已除去二氧化碳的水，振蕩器劇烈振蕩5 min，靜置3 h后，采用pH計(jì)檢測浸出液pH值。

1. 2 菌株分離和純化

配制MM培養(yǎng)基分裝至25 mL厭氧管中，每管10 mL，氮吹儀鼓氬氣除氧10 min后高溫蒸汽(121℃，0.1 MPa)滅菌20 min，備用。在厭氧手套箱中稱取0.2 g沉積物樣品，放入培養(yǎng)基中，加入2.0 mM丙酮酸鈉作為碳源/電子供體，2.0 mM As作為電子受體,置于培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)一周。待As完全還原后將富集液按體積比1∶10轉(zhuǎn)接至新培養(yǎng)基中，如此轉(zhuǎn)接3輪，得到生長繁殖穩(wěn)定的砷還原菌富集液。用Huntage厭氧滾管法分離砷還原單菌，厭氧管配制MM固體培養(yǎng)基，取富集液100.0 μL逐級稀釋10、10、10、10后，各濃度梯度取300.0 μL注入未凝固的固體培養(yǎng)基中，迅速橫向置于冰上滾動至培養(yǎng)基凝固，置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3 d。待管壁長出乳白色單菌落，使用一次性滅菌接種針挑取菌落至液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。為了得到單菌，取培養(yǎng)后的菌液重復(fù)上述滾管操作純化2次。

1.3 菌株Bacillus sp.strain P3-23鑒定

取1.0 mL菌液用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，測量DNA濃度。使用16S rDNA擴(kuò)增引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR程序設(shè)為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火65℃ 45 s，延伸72℃ 1 min(以上變性、退火、延伸共35個(gè)循環(huán))，延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 500 bp左右有亮帶的PCR產(chǎn)物送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序后序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析后，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌液涂布于MM固體培養(yǎng)基，有氧培養(yǎng)2 d長出單菌落，觀察單菌落形態(tài)特征。菌株P(guān)3-23經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 菌株Bacillus sp.strain P3-23的生長、功能特性及耐砷檢測

擴(kuò)大培養(yǎng)純化后的菌株P(guān)3-23，以4℃、6 500 r/min離心10 min收集菌體。為了檢測菌株對不同有機(jī)電子供體/碳源利用情況，將菌體分別接種至含乳酸鈉、乙酸鈉、甲酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甲醇、乙醇、丙三醇以及酵母提取物(酵母味素)的無菌MM培養(yǎng)基中，濃度均為2.0 mM。為了檢測菌株在不同溫度下的生長狀況，將菌體接種至含2.0 mM丙酮酸鈉的滅菌MM培養(yǎng)基中，分別置于4℃、22℃、30℃、37℃、45℃、60℃厭氧培養(yǎng)。調(diào)節(jié)MM液體培養(yǎng)基pH值分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.4、8.4，30℃以上每個(gè)變量設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，30℃厭氧培養(yǎng)72 h后收集樣品檢測細(xì)菌的生長程度以及As還原率。以上試驗(yàn)使用同一批擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體同時(shí)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，且保持取樣時(shí)間同步。

為了檢測菌株P(guān)3-23的耐砷特性，將菌株接種至砷濃度分別為0.0 mM、1.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、30.0 mM和40.0 mM的MM培養(yǎng)基中有氧振蕩培養(yǎng)20 h，間隔2 h取樣一次測量

OD

。為了檢測菌株P(guān)3-23砷還原特性，設(shè)置以下試驗(yàn)：培養(yǎng)基中加入2.0 mM丙酮酸鈉和2.0 mM砷酸鈉，3組試驗(yàn)組加入等量等濃度的菌液，設(shè)置空白對照一組，加入與試驗(yàn)組菌液等體積的無菌培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)3 d，間隔一定時(shí)間取樣一次，取樣完畢測試菌懸液光密度值和As濃度。

1.5 菌株Bacillus sp. strain P3-23對含砷沉積物的影響

為了檢測菌株P(guān)3-23對含砷沉積物的影響，設(shè)置以下試驗(yàn)：①滅活沉積物+丙酮酸鈉；②滅活沉積物+丙酮酸鈉+菌株P(guān)3-23。試驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。

配置人工合成地下水培養(yǎng)基，稱取0.2 g采集的石門沉積物樣品，放入50 mL厭氧瓶中，裝入20 mL人工合成地下水培養(yǎng)基后氮吹儀鼓入高純度氬氣(>99.9%)除氧20 min，塞緊橡膠塞，鋁蓋封口，高溫高壓滅菌備用。在紫外線照射30 min滅菌后的厭氧手套箱中將收集的純化后菌體接種至上述培養(yǎng)基中。所有試驗(yàn)都設(shè)置3組平行試驗(yàn)，放置于振蕩培養(yǎng)箱，30℃、120 r/min避光培養(yǎng)。從接種時(shí)間開始，每間隔一定時(shí)間取樣一次，檢測溶液中可溶性總砷含量及As濃度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 土壤樣品中含砷量檢測

土壤砷含量一般為5.0～15.0 mg/kg。石門土壤樣品中總砷含量為1 259.38 mg/kg，可溶砷含量為295.99 mg/kg，結(jié)果表明：石門采樣地土壤砷污染異常嚴(yán)重，高濃度的可溶性砷含量表明砷還原微生物的存在。土壤pH值為5.74，偏酸性，微生物存在于此環(huán)境中進(jìn)化出耐酸能力。

2.2 單株Bacillu sp. strain P3-23的分離與鑒定

厭氧管滾管挑取單菌落到液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，取菌液提取細(xì)菌DNA，使用Thermo Nanodrop one檢測其濃度為26.94 ng/μL。擴(kuò)增16S rRNA基因，測序后序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析,結(jié)果顯示其與菌株

Bacillu

niaini

strain Et9/1同源性最高，序列相似性為98.7%，與芽孢桿菌屬菌株DRG4、NBPP3、SJC-04、IDA115和IDA3307的相似性分別為97.40%、97.40%、97.39%、97.34%和97.0%。因此，P3-23為芽孢桿菌屬(

Bacillus

)成員，故命名為

Bacillu

sp. strain P3-23(以下簡稱P3-23)，基因文庫中編號為MT912948。與其同屬的E1H是一株已被報(bào)道的呼吸性砷還原菌。菌株

Bacillus

sp. strain P3-23 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析見圖1。 菌株P(guān)3-23形態(tài)特性顯示：在MM固體平板上呈圓形，中間微隆起，黏稠光滑，菌落中間為乳白色，沿周邊逐漸呈現(xiàn)透明狀。革蘭氏染色結(jié)果呈藍(lán)紫色，表明其為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株Bacillus sp. strain P3-23 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree constructed from the multiple sequence alignment of the 16S rRNA gene of strain Bacillus sp.P3-23 and its closely related species

2.3 不同條件下菌株Bacillu sp. strain P3-23的生長狀況檢測

不同溫度條件下厭氧培養(yǎng)3 d后菌株P(guān)3-23的生長狀況和砷還原率檢測結(jié)果，見圖2。

圖2 不同溫度條件下菌株P(guān)3-23的生長狀況和砷 還原率Fig.2 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different temperatures

由圖2可見，4℃、45℃和60℃條件下，菌株不生長；22℃、30℃和37℃條件下生長良好，30℃為菌株P(guān)3-23最適宜的生長溫度；4℃、22℃、30℃、37℃、45℃、60℃條件下對應(yīng)的As(Ⅴ)還原率分別為3.2%、63.8%、98.6%、92.7%、5.6%、2.6%，可見30℃條件下菌株P(guān)3-23還原As(Ⅴ)的能力最強(qiáng)。

不同碳源/電子供體條件下菌株P(guān)3-23的生長狀況和砷還原率檢測結(jié)果，見圖3。

圖3 不同碳源/電子供體條件下菌株P(guān)3-23的生長狀況 和砷還原率Fig.3 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different kinds of electron donor

由圖3可見，菌株P(guān)3-23不能利用乙酸鈉、甲酸鈉、甲醇和乙醇作為電子供體；利用酵母味素、丙三醇、檸檬酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、蔗糖和丙酮酸的情況下，As(Ⅴ)還原率分別為38.4%、78.3%、86.6%、91.7%、92.1%、92.9%和94.7%；丙酮酸鈉是菌株P(guān)3-23進(jìn)行砷還原作用最適宜的電子供體，蔗糖為其生長繁殖最適宜的碳源；菌株P(guān)3-23在利用酵母味素過程中，As(Ⅴ)還原率僅為38.4%，但菌株生長狀況良好，

OD

值顯著高于其他有機(jī)電子供體，說明菌株P(guān)3-23在營養(yǎng)豐富能滿足自身生長繁殖的情況下，不會持續(xù)進(jìn)行砷還原作用；菌株P(guān)3-23可利用葡萄糖和蔗糖進(jìn)行糖酵解作用，可溶性小分子有機(jī)酸化合物檸檬酸鈉、乳酸鈉和丙酮酸鈉也能被P3-23充分利用，其中丙酮酸作為糖酵降解過程的最終產(chǎn)物，是P3-23進(jìn)行砷還原作用最適宜的碳源/電子供體。因乙醇和甲醇對生物具有毒害作用，3種醇類物質(zhì)中P3-23只能利用丙三醇。

在不同pH值條件下，菌株P(guān)3-23的生長情況和砷還原率見圖4。

圖4 不同pH值條件下菌株P(guān)3-23的生長狀況及砷還原率Fig.4 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different pH values

由圖4可見，菌株P(guān)3-23在pH值小于3.5和大于7.5的條件下不能生長,在pH值為3.5、4.5、5.6、6.5、7.5的條件下均可還原As(Ⅴ)，但在堿性條件下P3-23無法生存，說明P3-23是一株耐酸菌，在pH值為3.5條件下不僅能生長，而且能正常進(jìn)行砷還原作用。湖南石門雄黃礦區(qū)土壤逐漸酸化，P3-23在酸性環(huán)境中進(jìn)化出耐酸機(jī)制，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)。

2.4 菌株Bacillus sp. strain P3-23砷還原和砷耐性檢測

菌株P(guān)3-23的砷還原檢測結(jié)果，見圖5。

圖5 菌株P(guān)3-23的砷還原曲線Fig.5 Arsenate reduction curves of strain P3-23

由圖5可見，菌株P(guān)3-23在72 h內(nèi)能完全還原2.0 mM As(Ⅴ)，菌液濃度隨著砷還原率的增加而增長。

不同砷濃度條件下菌株P(guān)3-23的生長曲線見圖6。

圖6 不同砷濃度下菌株P(guān)3-23的生長曲線Fig.6 Growth curves of strain P3-23 in the presence of different As concentration

由圖6可見，菌株P(guān)3-23在0.0 mM、1.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、30.0 mM和40.0 mM的砷濃度下均能生長，最適宜生長的砷濃度為1.0 mM，當(dāng)砷濃度達(dá)到40.0 mM時(shí)菌株的生長受到明顯的抑制但仍能生存。菌株P(guān)3-23具有強(qiáng)耐砷能力，且在適宜的砷濃度條件下生長狀況更良好，這說明該菌株長期生存于砷污染土壤中,一定濃度砷存在的環(huán)境，更適合P3-23生長繁殖。

2.5 菌株Bacillu sp. strain P3-23對高砷土壤砷釋放的影響

菌株P(guān)3-23對石門高砷土壤砷釋放的影響見圖7。

圖7 菌株P(guān)3-23對石門高砷土壤砷釋放的影響Fig.7 Effect of strain P3-23 on the release of arsenic from the high-arsenic soil of Shimen

由圖7可知，菌株P(guān)3-23對石門高砷土壤可溶性砷釋放有明顯的促進(jìn)作用，分別在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、9 d、11 d檢測到可溶性砷濃度分別為6.9 μM、17.5 μM、50.3 μM、61.0 μM、114.1 μM、166.5 μM和201.9 μM，檢測砷形態(tài)分析表明As占比達(dá)83.3%以上，未接種P3-23滅活土壤中只能檢測到微量可溶性砷?？梢?，菌株P(guān)3-23能顯著促進(jìn)石門高砷土壤中砷的釋放過程，這是由于土壤中吸附態(tài)As(Ⅴ)在其砷還原作用下轉(zhuǎn)化為遷移性更強(qiáng)的As(Ⅲ),土壤砷在淹水條件下釋放并在水體中積累，通過地表徑流及滲透作用污染地表水及地下水，增加人體暴露于高濃度砷的可能性。

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)從石門高砷土壤中分離出一株耐酸性砷還原菌，根據(jù)其16S rRNA基因序列分析初步確定其屬于芽孢桿菌屬，故命名為

Bacillu

sp. strain P3-23(簡稱P3-23)。生物學(xué)試驗(yàn)和砷形態(tài)分析結(jié)果表明：菌株P(guān)3-23砷還原功能強(qiáng)，最適宜的碳源為丙酮酸鈉，可在72 h內(nèi)將2.0 mM As(Ⅴ)完全還原。菌株P(guān)3-23具有較強(qiáng)的砷抗性，40.0 mM砷存在的條件下仍可生長，其同時(shí)具有很強(qiáng)的耐酸性，pH值低至3.5的條件下仍可正常進(jìn)行砷還原作用。高砷土壤砷釋放試驗(yàn)中菌株P(guān)3-23能明顯增加土壤中可溶性砷含量，表明砷還原微生物是吸附態(tài)、結(jié)合態(tài)砷釋放的主要驅(qū)動力量，一方面可作為土壤砷修復(fù)過程中砷生物浸出方法的研究材料，另一方面是造成水體砷污染的關(guān)鍵因素。因此，研究砷還原微生物對砷污染成因及其修復(fù)機(jī)制具有重要意義。耐酸性砷還原菌的分離鑒定表明：砷還原菌生存范圍廣，預(yù)示著其可能存在于各種極端環(huán)境中，關(guān)注極端環(huán)境中砷還原微生物的作用，對完善砷的生物地球化學(xué)循環(huán)模式具有重要的意義。