水酶法提取百香果籽油工藝優(yōu)化研究

黃欣欣 艾靜汶 謝朝敏 葉雪英 劉功德

摘 要：采用水酶法從百香果籽中提取百香果籽油。首先，采用單因素方法對復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比四個(gè)因素進(jìn)行考查，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化。最佳工藝條件為：復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，料液比1∶3，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間5 h，此條件下百香果籽油的提取率為62.96%。試驗(yàn)所得百香果籽油理化指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，并且其中亞油酸含量為67.10 g/100 g、油酸含量為15.80 g/100 g、棕櫚酸9.51 g/100 g，不飽和脂肪酸含量豐富且得到很好的保留。

關(guān)鍵詞：百香果籽油;水酶法;優(yōu)化;理化性質(zhì)

中圖分類號：TS224? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization of Aqueous Enzymatic Extraction of

Passion Fruit Seed Oil

HUANG Xinxin，AI Jingwen，XIE Chaomin，YE Xueying，LIU Gongde

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning，Guangxi 530001，China）

Abstract：The aqueous enzymatic method was used to extract the seed oil from passion fruit. Firstly，the four factors：compound enzyme addition，enzymatic hydrolysis temperature，enzymatic hydrolysis time and solid-liquid ratio were investigated by single factor method. On this basis，the orthogonal test of four factors and three levels was carried out. The optimum technological conditions by orthogonal? array experiments were as follows： the amount of compound enzyme （neutral protease： pectinase： cellulase = 2∶1∶1） was 4%，the ratio of solid to liquid was 1∶3，the enzymatic hydrolysis temperature was 55 ℃，the enzymatic hydrolysis time was 5 h. Under the above conditions，the extraction rate of passion fruit seed oil was 62.96%，the physicochemical indexes of the oil met the national standards，the content of linoleic acid was 67.10g/100 g，oleic acid was 15.80g/100 g，palmitic acid was 9.51g/100 g，and the content of unsaturated fatty acids was rich and well retained.

Key words：Passion fruit seed oil;aqueous enzymatic;extraction; optimization;physical and chemical properties

百香果，又名雞蛋果、西番蓮，屬西番蓮屬（Passion fruit granadilla）。20世紀(jì)初，中國于日本東京引進(jìn)紫色百香果，現(xiàn)在云南、廣西、廣東、海南等地都有栽培[1]。百香果果實(shí)含有果皮、果汁和果籽，其中果籽占果實(shí)質(zhì)量的6%～12%[2]。百香果籽中脂肪含量約為30%，其中脂肪酸主要成分為亞油酸、油酸、棕櫚酸等。此外，百香果籽油中還富含類胡蘿卜素和酚類化合物等多種抗氧化活性成分[3]，是一種優(yōu)質(zhì)的植物油資源。

目前，百香果籽油的提取方法有物理壓榨法[4]、索式提取法[5]、超聲波輔助溶劑提取法[6]、微波輔助溶劑提取法[7]、超臨界CO2提取法[8]等。物理壓榨是依靠壓力對原料進(jìn)行粉碎擠壓將油脂直接分離，具有無添加、無污染的優(yōu)點(diǎn)，但對原料的含油量有比較高的要求。索式提取法操作簡單，油脂獲得率較高，但容易產(chǎn)生溶劑殘留，部分有機(jī)溶劑有毒性且提取物中雜質(zhì)較多。與上述提取方法相比較，水酶法提油綠色安全，污染少且對原料的含油量要求不高;提取的原油質(zhì)量較好，便于進(jìn)行下一步的精煉操作;提油的整個(gè)操作處理溫和，能夠保存油料當(dāng)中的營養(yǎng)成分。水酶法是先利用機(jī)械（如超聲波等）外力破壞油料細(xì)胞組織以及脂蛋白、脂多糖等油脂復(fù)合體，通過加入纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等生物酶制劑對細(xì)胞組織和油脂復(fù)合體進(jìn)行降解，從而使油脂得以游離出來。水酶法工藝溫和，操作簡單，能有效回收原料中的蛋白質(zhì)及碳水化合物，且具有抗氧化成分的多酚類等得以較好保留[9]。

本研究采用水酶法提取百香果籽油，對原料預(yù)處理工藝對比優(yōu)選，以百香果籽油提取率為考察指標(biāo)，利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化水酶法提取工藝條件，并測定試驗(yàn)得到的百香果籽油的理化性質(zhì)，為其開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

臺農(nóng)百香果：廣西桂平匯鑫百香果種植合作社。中性蛋白酶（酶活50000u/g，最適pH值6～7.5，最適溫度40～60℃）、纖維素酶（酶活10000 u/g，最適pH值5～8，最適溫度40～60℃）、果膠酶（酶活30000 u/g，最適pH 5.5～7.5，最適溫度50～65℃）：鄭州萬搏化工產(chǎn)品有限公司。冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、石油醚、無水硫酸鈉、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、異丙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、95%乙醇、酚酞、百里香酚酞、堿性藍(lán)6B、無水硫酸鈉、無水乙醚、鹽酸、氨水、焦性沒食子酸、三氟化硼甲醇、氯化鈉、硫酸氫鈉、氫氧化鉀：分析純。異辛烷、甲醇、正庚烷：色譜純。

LT-27系列電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：中山市好何優(yōu)電器廠。XL-30C高速連續(xù)粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。L-550臺式低速大容量離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司。CP214電子天平：奧豪斯儀器有限公司。HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。美菱BCD-253WP3L電冰箱：合肥美菱股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理方式的選擇

稱取100g粉碎后的百香果籽分別采用120℃蒸汽處理10 min、 100℃蒸汽處理10 min、微波400W處理5 min進(jìn)行預(yù)處理，以未作處理作為對照組，按1.2.2的提取工藝進(jìn)行水酶法提取，對比采用不同預(yù)處理工藝對百香果籽油提取率的影響。

1.2.2 提取工藝

選用新鮮采摘、外表無損壞的百香果作為原料，分離60℃烘干后得到百香果籽，用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎破壁，稱取100g經(jīng)粉碎過40目篩后的百香果籽進(jìn)行預(yù)處理，加入適量的蒸餾水制成勻漿，添加一定量的酶制劑（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）后攪拌混合均勻，酶解一定時(shí)間，將酶解容器置于90℃滅酶20 min，冷卻至室溫，于-20℃冷凍處理24 h，后取出在40℃水浴解凍3h，解凍后離心（4000 rpm，15 min），吸取上層清油，低溫烘干至恒重，計(jì)算百香果籽油提取率。

1.2.3 百香果籽油提取率計(jì)算

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 復(fù)合酶添加量對百香果籽油提取率的影響

在料液比1∶3，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間5 h條件下，分別采取2%、3%、4%、5%、6%復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量提取百香果籽油，考察復(fù)合酶添加量對百香果籽油提取率的影響。

1.2.4.2 酶解溫度對百香果籽油提取率的影響

在料液比1∶3，復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，酶解時(shí)間5h條件下，分別采取45℃、50℃、55℃、60℃、65℃酶解溫度提取百香果籽油，考察酶解溫度對百香果籽油提取率的影響。

1.2.4.3 酶解時(shí)間對百香果籽油提取率的影響

在料液比1∶3，復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，酶解溫度55℃條件下，分別采取3h、4h、5h、6h、7h酶解時(shí)間提取百香果籽油，考察酶解時(shí)間對百香果籽油提取率的影響。

1.2.4.4 料液比對百香果籽油提取率的影響

在復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間5h條件下，分別采取料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5提取百香果籽油，考察料液比對百香果籽油提取率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比為試驗(yàn)因素，以百香果籽油提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)并進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.6 百香果籽油理化指標(biāo)測定

酸價(jià)的測定：參照GB 5009.229-2016《食品中酸價(jià)的測定》[10]。過氧化值的測定：參照GB 5009.227-2016《食品中過氧化值測定》[11]。脂肪酸的測定：參照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測定（第三法）》[12]。百香果籽油質(zhì)量評價(jià)參考GB 2716-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行三次及以上，數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對百香果籽油提取率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，預(yù)處理方式對百香果籽油的提取率影響較大。120℃蒸汽處理10 min后提取率最高，可達(dá)51.20%，100℃蒸汽處理10 min后提取率為48.52%。蒸汽處理類似于蒸饅頭，一方面既可以使物料內(nèi)外結(jié)構(gòu)蓬松增加酶接觸表面積，另一方面又使得物料內(nèi)部相關(guān)脂肪酸酶和其他抑酶因子失活，更有利于水酶法提油[14]。微波處理后提取率低于未處理，當(dāng)微波處理超過5 min時(shí)，樣品將發(fā)生熱損傷，使得出油率下降。眾多研究還表明微波處理嚴(yán)重影響油品質(zhì)，如酸價(jià)過氧化值升高，反式脂肪酸增加，生育酚發(fā)生降解等[15]。蒸汽處理的時(shí)間過長，可能會導(dǎo)致油脂結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)導(dǎo)致乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，使得提取率下降[16]，綜合能源消耗考慮，因此選取120℃蒸汽處理10 min為實(shí)驗(yàn)最佳預(yù)處理方式。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶添加量對百香果籽油提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)復(fù)合酶的添加量在2%～4%范圍內(nèi)，隨著酶添加量增加，百香果籽油的提取率也逐漸升高;當(dāng)復(fù)合酶添加量大于4%時(shí)，提取率變化不大，甚至出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，酶制劑與底物能夠充分反應(yīng)，當(dāng)超過一定添加量后，過量的酶會產(chǎn)生競爭性的抑制作用，影響了復(fù)合酶的整體的酶解效率。因此，適宜的復(fù)合酶添加量為4%。

2.2.2 酶解溫度對百香果籽油提取率的影響

由圖3可知，隨著溫度從45℃升高到55℃，百香果籽油的提取率逐漸增加。當(dāng)溫度升高至60℃后，提取率出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，若溫度繼續(xù)升高達(dá)到65℃后，提取率明顯降低。這是因?yàn)樵谥行缘鞍酌福ㄗ钸m溫度40～60℃）、纖維素酶（最適溫度40～60℃）、果膠酶（最適溫度50～65℃）的最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，促進(jìn)了酶與底物的反應(yīng)速度，加速酶解過程，但當(dāng)溫度升高超過復(fù)合酶的最適溫度后，酶可能由于高溫導(dǎo)致變性從而失去活力，提取率出現(xiàn)急劇下降。因此，選取適宜的提取溫度55℃。

2.2.3 酶解時(shí)間對百香果籽油提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的增加提取率也逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí)，達(dá)到最大的提取率，隨后提取率逐漸穩(wěn)定，變化不大?？梢酝茰y，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，底物逐漸減少，復(fù)合酶不斷產(chǎn)生酶解作用，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5 h時(shí)，底物全部消耗，酶解過程基本結(jié)束，提取率幾乎不變。考慮到節(jié)約能源，選取適宜的酶解時(shí)間為5 h。

2.2.4 料液比對百香果籽油提取率的影響

由圖5可知，隨著料液比的增加，百香果籽油的提取率也逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶3時(shí)，提取率達(dá)到最大值，若料液比繼續(xù)增加，提取率則出現(xiàn)下降的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著水量的增加，促進(jìn)了酶與底物的擴(kuò)散，產(chǎn)生足夠空間使得酶與底物充分接觸、碰撞和反應(yīng)。但當(dāng)料液比超過1∶3后，大量的水降低了酶與底物的濃度，使二者的接觸概率減少，從而導(dǎo)致了提取率的下降。因此，選取適宜的料液比為1∶3。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇以復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間及料液比作為試驗(yàn)因素，以百香果籽油提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)并試驗(yàn)，結(jié)果與極差分析見表2。

由表2可知，極差RA>RD>RB>RC說明四個(gè)因素對試驗(yàn)指標(biāo)百香果籽油提取率影響的主次順序?yàn)锳>D>B>C，即復(fù)合酶的添加量對提取率的影響最大，其次是料液比和溫度，而酶解時(shí)間的影響較小。根據(jù)各因素的k值可以判斷水酶法提取百香果籽油最佳工藝組合為A2B2C2D2。經(jīng)驗(yàn)證，在最優(yōu)條件下，即復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，料液比1∶3，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間5 h，百香果籽油的提取率可達(dá)62.96%。

2.4 百香果籽油理化指標(biāo)測定

采用正交試驗(yàn)得到的最佳水酶法工藝提取百香果籽油，測定其部分理化指標(biāo)及主要脂肪酸含量，測定結(jié)果如表3所示。該工藝制得的百香果籽油酸價(jià)不大于3 mgKOH/g，過氧化值不大于0.25 g/100g，符合GB 2716-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》。此外，百香果籽油中油酸、棕櫚酸，特別是亞油酸含量豐富且得到很好的保留。百香果籽油色澤清透明亮，有酸甜水果香氣，質(zhì)地溫和不油膩，無刺激性，且品質(zhì)良好、安全穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

采用水酶法提取百香果籽油，對原料預(yù)處理工藝進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)表明120℃蒸汽處理10 min為最佳預(yù)處理方式。為了進(jìn)一步提高百香果籽油的提取率，通過單因素和正交試驗(yàn)確定了水酶法提取百香果籽油的最佳工藝條件為：復(fù)合酶（中性蛋白酶∶果膠酶∶纖維素酶=2∶1∶1）添加量為4%，料液比1∶3，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間5 h，此條件下百香果籽油的提取率為62.96%。該工藝制得的百香果籽油酸價(jià)不大于3 mgKOH/g，過氧化值不大于0.25 g/100 g，符合GB 2716-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》。此外，百香果籽油中亞油酸含量為67.10? g/100 g、油酸含量為15.80 g/100 g、棕櫚酸9.51 g/100 g，不飽和脂肪酸含量豐富且得到很好的保留。

本文雖然通過單因素和正交試驗(yàn)對百香果籽油的水酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，且通過試驗(yàn)得到的最佳工藝條件，提取率較高，百香果籽油的品質(zhì)較好。但在實(shí)驗(yàn)離心分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，水油層中間存在一個(gè)乳化層，乳化層仍含有少部分的油脂，若想進(jìn)一步提高提取率，下一步的研究可以對乳化層的破乳工藝進(jìn)行研究。

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