常壓中溫下水稻秸稈預處理及酶解研究

白光劍，馬一凡，鄒偉*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644005) 2(濃香型白酒資源微生物與大數(shù)據(jù)實驗室，四川 宜賓，644005)

木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的有機資源，每年生物圈中可產(chǎn)生大約850億t，人類僅利用了4.8%[1]。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)獨特，是植物經(jīng)億萬年自然選擇的結(jié)果，微生物很難快速、直接的將其降解轉(zhuǎn)化，對于生物質(zhì)資源開發(fā)利用是一大難題。大部分的木質(zhì)纖維素都需要先經(jīng)過一定的預處理才能被微生物快速利用，預處理是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素高值轉(zhuǎn)化的重要過程。美國國家研究委員會認為好的預處理是不需要減小生物質(zhì)的粒度，保留半纖維素組分，降低抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成，使能耗和成本最低等[2]。中國科學院過程工程研究院陳洪章等指出：理想的預處理應該集中在木質(zhì)素的去除，以保持細胞壁中結(jié)構(gòu)多糖的完整性，以實現(xiàn)生物質(zhì)的全利用；同時，希望預處理過程在“常壓”下進行，并且使用最小的預處理能耗、價格低廉的預處理化學品和盡可能少的用量[3-4]。

水稻秸稈作為世界三大農(nóng)作物秸稈之一，全世界2016年水稻秸稈產(chǎn)量約在12.67億t，其中中國約2.28億[5]t。水稻秸稈結(jié)構(gòu)獨特，生物質(zhì)頑抗性[6]很強，結(jié)晶度高，難以直接利用[7]，導致大量的秸稈資源被白白浪費，其資源化的高效利用具有重要意義，水稻秸稈生物煉制是一個重要的方向。但未經(jīng)過預處理的水稻秸稈難以被微生物利用，因此需要高效的水稻秸稈預處理技術(shù)。

根據(jù)木質(zhì)纖維素預處理的相關(guān)研究報道，化學處理是生產(chǎn)中最常用的、適于大規(guī)模推廣的預處理方式。但許多研究為高溫高壓高濃度的預處理技術(shù)，對于水稻秸稈的常壓中溫低濃度的預處理技術(shù)研究較少。本研究探究常壓中溫低濃度下的、不減小生物質(zhì)粒度的堿預處理方法，旨在為溫和的水稻秸稈預處理技術(shù)提供相應的研究探索，為水稻秸稈的相關(guān)生物煉制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

秸稈來自江蘇宿遷某農(nóng)田，用鍘刀鍘成1～2 cm的小段，烘干用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑與儀器

QYC-2102搖床，上海滬奧明科學儀器有限公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱，四川蜀科儀器有限公司；TG-16醫(yī)用離心機，四川蜀科儀器有限公司；V-1000可見分光光度，翱藝儀器有限公司；HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造；VEGA 3SBU掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司；Nicolet 6700 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司。

里氏木霉CICC 41027，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；纖維素酶C8270，北京Solarbio。

纖維素酶液:稱取 0.200 0 g纖維素酶，溶于pH 4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，并用此緩沖液定容至100 mL，濃度為2 mg/mL。測得此酶液CMC酶活[8]為0.82 IU/mL，濾紙酶活(filter paper activing, FPA)為0.38 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活為0.38 IU/mL。酶液應現(xiàn)配現(xiàn)用。

里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基：預處理秸稈(未處理秸稈)20 g，蛋白胨1 g，(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO22 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，吐溫-80 1 mL，H2O 1 000 ml，調(diào)節(jié)pH 5.5～6.0。

2 實驗方法

2.1 預處理

實驗流程：水稻秸稈→切段(1～2 cm)→烘干→不同條件下處理→水洗→烘干→酶解→計算產(chǎn)糖量

預處理：準確稱取20 g烘干秸稈，裝于抗腐蝕的濾袋(M0)中，記錄秸稈和濾袋總重M1，裝于500 mL廣口瓶中，浸沒于不同的處理液中，固液比1∶10(g∶mL)，用保鮮膜套在瓶塞前防止腐蝕，置于對應溫度的恒溫培養(yǎng)箱中(加溫度計校正)，每12 h翻動一次。浸泡處理結(jié)束后，水洗至中性，70 ℃烘干36 h，待用，記錄總重量M2。

2.1.1 不同試劑處理秸稈

根據(jù)預實驗和文獻參考，選擇NaOH、Ca(OH)2、亞硫酸鈉、尿素、稀硫酸配制成相應濃度稀溶液，固液比為1∶10(g∶mL)，將秸稈浸沒其中，于50 ℃下處理36 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.2 預處理溫度

選擇2.1.1中效果最好試劑NaOH進行溫度單因素實驗，將處理溫度設置為20、30、40、50、60 ℃，固液比1∶10，質(zhì)量濃度1 g/dL，處理36 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.3 不同時間

在NaOH質(zhì)量濃度1 g/dL，溫度50 ℃，固液比1∶10的條件下，選擇不同浸泡時間，6、16、24、36、48、72 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.4 不同濃度

在溫度50 ℃，處理時間48 h，固液比1∶10的條件下，選擇不同質(zhì)量濃度的NaOH溶液，0、0.4、0.8、1、1.2、1.4、1.6、2 g/dL，水洗、烘干、酶解。

2.1.5 響應面

以單因素實驗結(jié)果為基礎和Box-Behnken實驗原理，以初始秸稈比產(chǎn)糖量為響應值，分析NaOH預處理秸稈過程中溫度、時間、NaOH濃度3個因素對秸稈酶解產(chǎn)糖的影響。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

2.3 酶解

準確稱取0.500 0 g預處理烘干至恒重的秸稈，置于150 mL錐形瓶中，加45 mL檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L， pH 4.8)，加5 mL配制好的標準酶液，將錐形瓶封口后置于恒溫搖床，50 ℃，80 r/min，酶解72 h，取樣測還原糖[9]。

取酶解液5 mL于離心管中，8 000 r/min，離心5 min，取上清液用DNS法測還原糖含量[10]，計算產(chǎn)糖量。

預處理后秸稈保留量(g/g):預處理過程中會有木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、脂肪等物質(zhì)的流失，處理強度越大秸稈質(zhì)量流失越嚴重，通過對預處理前后質(zhì)量的檢測，計算出單位初始秸稈經(jīng)過預處理后剩余質(zhì)量，作為對預處理的評估指標之一。

(1)

預處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g):對預處理后的秸稈用標準酶液在適宜的酶解條件下酶解，使纖維素、半纖維素變成還原糖，測單位預處理秸稈在相同酶解條件下還原糖的產(chǎn)量，產(chǎn)糖量越多說明其預處理效果越好，更利于秸稈纖維素的分解轉(zhuǎn)化。

預處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)=

(2)

初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g):在一定的預處理強度范圍內(nèi)，預處理后的單位秸稈酶解產(chǎn)糖量隨著預處理強度增加，對秸稈結(jié)構(gòu)的破壞程度越強，其酶解產(chǎn)糖量也越高，但同時預處理造成的秸稈質(zhì)量損失也越多，因此引入單位初始秸稈經(jīng)過預處理和酶解后的產(chǎn)糖量作為預處理的綜合評估指標。

初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)=預處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)×預處理秸稈保留率

(3)

2.4 電鏡掃描

取未處理和預處理的水稻秸稈，制片、噴金，用電子掃描顯微鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，比較結(jié)構(gòu)變化。

2.5 紅外光譜分析

取未預處理和預處理的水稻秸稈，粉碎為40目粉末，進行紅外光譜分析，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1,比較預處理前后秸稈結(jié)構(gòu)和官能團的變化。

2.6 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

以秸稈為唯一碳源，分別取預處理和未處理秸稈2 g，配制液態(tài)培養(yǎng)基，于250 mL錐形瓶裝液100 mL接種5 mL里氏木霉種子液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，測發(fā)酵液中的還原糖和FPA酶活[10]。

2.7 統(tǒng)計分析

采用Excel對試驗數(shù)據(jù)初步處理，再用Design Expert 8.0處理數(shù)據(jù)，Origin8.5作圖，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

3 結(jié)果

3.1 預處理結(jié)果

3.1.1 不同試劑

根據(jù)秸稈類原料預處理的相關(guān)文獻[11-12]，選擇NaOH、Ca(OH)2、Na2SO3，尿素，H2SO4等幾種對秸稈預處理效果較好的化學試劑作為預處理試劑[13]，在預設的較溫和預處理條件下比較預處理效果。由于Na2SO3、尿素、H2SO4在同類預處理研究中所用濃度較高，故本試驗中其濃度為NaOH、Ca(OH)2的2倍。由圖1可知，從秸稈保留量來看，在實驗條件下，NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑處理明顯對秸稈的結(jié)構(gòu)造成了影響，而Na2SO3、尿素對秸稈質(zhì)量的影響小，同時對其預處理后的秸稈質(zhì)地觀察，發(fā)現(xiàn)秸稈結(jié)構(gòu)完整，處理前后變化小。從產(chǎn)糖量來看，經(jīng)Na2SO3，尿素溶液處理后的秸稈，纖維素酶基本不能酶解，結(jié)合相關(guān)研究，說明在本試驗所選擇的溫和條件下，Na2SO3、尿素，不適合作為處理試劑。

圖1 不同化學試劑對預處理的影響Fig.1 Effect of different chemical reagents on pretreatment

由圖1可知NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑溶液對水稻秸稈有處理效果，預處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.329、0.228、0.092 g/g，初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.193、0.167、0.062 g/g，結(jié)合同類研究[14]，Ca(OH)2對秸稈有不錯的效果，但一般處理時間較長，而H2SO4對秸稈的處理機制是溶解半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖[12]，許多還原糖直接溶于處理液中[15]，對打破秸稈結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的去除是不如堿處理的[16]。與同類研究結(jié)果能相互印證[17]，結(jié)合試驗目的，最終選擇NaOH作為后續(xù)實驗試劑。

3.1.2 不同溫度的預處理

由圖2可知在固液比1∶10，NaOH濃度1 g/dL，36 h條件下預處理，秸稈保留量隨溫度升高而減少，而同時預處理秸稈產(chǎn)糖量隨溫度升高而增加，說明隨著溫度升高，在處理液的作用下秸稈的結(jié)構(gòu)被破壞程度越高，秸稈更容易被纖維素酶酶解為還原糖，這符合秸稈預處理過程的理論。初始秸稈比產(chǎn)糖量隨溫度先升高后緩慢下降，在50 ℃時達到最高，而預處理秸稈產(chǎn)糖量仍在增加，說明隨著溫度的升高，秸稈保留量的減少與預處理秸稈產(chǎn)糖量增加的效能平衡開始向不利于比產(chǎn)糖量發(fā)生偏移。

圖2 溫度對預處理的影響Fig.2 Effect of temperature on pretreatment

3.1.3 不同時間的預處理

由圖3可知，在NaOH 1 g/dL，溫度50 ℃，固液比1∶10(g∶mL)的條件下，預處理時間越長，秸稈保留量越少，預處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量均隨時間先增加后減少，48 h達到最高。由圖3可知，3種評估指標隨時間的變化趨勢緩慢，說明時間因素對預處理影響較小。

圖3 處理時間對預處理的影響Fig.3 Effect of process time on pretreatment

3.1.4 不同濃度的預處理

由圖4可知，在溫度50 ℃，處理時間48 h，固液比1∶10的條件下，秸稈保留量隨濃度增加而減少，預處理秸稈產(chǎn)糖量隨濃度先增加后趨于平穩(wěn)最后開始減少，初始秸稈比產(chǎn)糖量先增加后平穩(wěn)后減少。在蒸餾水中浸泡秸稈質(zhì)量損失約為12%，但酶解產(chǎn)還原糖量幾乎沒有，僅為0.004 g/g，實驗中發(fā)現(xiàn)蒸餾水預處理后的秸稈，物理結(jié)構(gòu)和化學結(jié)構(gòu)基本無變化，酶解后變化也很小，與未處理秸稈酶解效果非常接近。相較于蒸餾水，經(jīng)0.4 g/dL NaOH溶液處理后，酶解后預處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量有明顯提升，分別為0.136 g/g和0.109 g/g。水稻秸稈結(jié)構(gòu)致密，結(jié)晶度高，頑抗性高，蒸餾水無法打破其結(jié)構(gòu)，而NaOH可以切斷木質(zhì)素和碳水化合物之間的連接鍵并破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，使碳水化合物更容易受到酶的攻擊[18]。由圖4可以看出在本試驗條件下，NaOH濃度在0～1 g/dL內(nèi)產(chǎn)糖量隨濃度增加趨勢大，在高于1 g/dL以后增長慢，并逐漸趨于平穩(wěn)，至16 g/dL后開始下降。初始秸稈比產(chǎn)糖量在1 g/dL時達到最大。

圖4 NaOH濃度對預處理的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on pretreatment

3.1.5 響應面試驗及分析

按表2進行回歸分析，初始秸稈比產(chǎn)糖量(R)的回歸方程:

R=0.22+0.021A+0.004 125B+0.069C-0.012AB-0.021AC-0.006BC+0.009 3A2+0.003 825B2-0.054C2

根據(jù)方差結(jié)果分析(表4)，模型項極顯著(P<0.01)；失擬項(P>0.05)不顯著。表明在試驗參數(shù)范圍內(nèi)，模型合理，可以用來推測和分析預處理試驗結(jié)果。由表3可知，3個因素對初始秸稈比產(chǎn)糖量的影響順序為C(濃度)>A(溫度)>B(時間)，其中一次項A、C，交互項AC、二次項C2對響應值極顯著(P<0.01)，B(時間)在試驗參數(shù)范圍內(nèi)對響應值初始秸稈比產(chǎn)糖量無顯著影響(P>0.05)。

表2 Box-Behnken設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface design

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

注:P<0.05(顯著，*)；P<0.01(極顯著，**)。

由圖5-A溫度和時間對預處理產(chǎn)糖交互作用圖可知，濃度一定時，處理時間越短，溫度對預處理的貢獻越大。在同類預處理研究中也證明溫度越高所需預處理時間越短,也有研究表明高溫長時間的預處理會使秸稈中可酶解的成分流失更多，反而預處理效果不好[18]。結(jié)合圖5-B和圖5-C可知在試驗條件下，預處理效果的對時間的響應小于溫度和濃度的。

A-溫度和時間；B-濃度和溫度；C-濃度和時間圖5 響應面交互作用圖Fig.5 Contour and interaction diagrams of response surface analysis

3.1.6 結(jié)果驗證

經(jīng)過響應面優(yōu)化，得到最適酶解的預處理條件參數(shù)為A(溫度) 56.7 ℃、B(時間) 29.52 h、C(濃度) 1.35%。在此條件下初始秸稈比產(chǎn)糖量最大預測值為0.256 g/g。為了便于操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為溫度55 ℃、時間30 h、濃度1.3%。在此條件下，進行3次試驗驗證，下初始秸稈比產(chǎn)糖量為 0.271 g/g，與預測值相比，誤差為1.06%。因此該模型能夠預測該條件下水稻秸稈預處理和初始秸稈比產(chǎn)糖量的關(guān)系。

3.2 預處理前后結(jié)構(gòu)變化

由圖6可知，未處理秸稈表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，呈規(guī)則的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，剛性強，不易被破壞；預處理后秸稈表面粗糙，蓬松柔軟，結(jié)構(gòu)坍塌，失去完整結(jié)構(gòu)。

A-未處理秸稈；B-預處理后的秸稈；C-未處理秸稈掃描電鏡圖；D-預處理秸稈掃描電鏡圖圖6 未處理(左)與堿處理秸稈(右)掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of untreated (left) and NaOH treated (right) straw

結(jié)合堿處理機理，OH離子能削弱半纖維素同纖維素之間的氫鍵和木質(zhì)素分子與半纖維素之間的酯鍵，使秸稈結(jié)構(gòu)被打破，使半纖維素和木質(zhì)素溶出，使得碳水化合物更容易受到酶的攻擊，同時由于NaOH的作用，纖維素發(fā)生水化膨脹，導致纖維素的聚合度和結(jié)晶度有所下降，木質(zhì)素和堿抽出物等組分降解和溶出以及原料空隙發(fā)生潤脹，使原料的多孔性增加和內(nèi)比表面積的增大，改善了酶的可滲透性，從而提高了酶與纖維素的接觸面積和酶的水解速率[18]。故經(jīng)過預處理的秸稈更易于纖維素酶的吸附、酶解。

3.3 紅外光譜分析

由圖7可知經(jīng)過預處理后，秸稈的部分特征峰發(fā)生了明顯變化。根據(jù)木質(zhì)纖維素官能團的特征峰所知[19-20]，3 426 cm-1處代表的是O—H伸展振動，而2 922 cm-1處的峰代表的是脂肪族中CH2和CH3伸縮振動，這些與纖維素及木質(zhì)素、半纖維素中的脂肪族基團相應；1 734 cm-1代表半纖維中的乙?；蛱侨┧狨ユI或者木質(zhì)素和半纖維素間通過阿魏酸或?qū)ο愣顾徇B接的酯鍵；1 604 cm-1代表芳香族骨架振動；1 246 cm-1代表愈創(chuàng)木基C—O；1 032 cm-1代表芳香碳氫鍵在平面變形。

圖7 預處理秸稈與未預處理秸稈紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of untreated and NaOH treated straw

這說明堿處理后，水稻秸稈外表面由長鏈脂肪酸形成的致密保護層被破壞，水稻秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間通過化學鍵連接的晶格結(jié)構(gòu)被打破，秸稈的頑抗性降低，結(jié)晶度減弱，微生物和酶更易進入到水稻秸稈的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，增強了微生物對水稻秸稈的生物降解性能。

3.4 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

由圖8可以看出，以未處理的水稻秸稈唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種里氏木霉后，發(fā)酵液中未見微生物生長，秸稈形態(tài)完整。與之相比，經(jīng)預處理的秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液變成里氏木霉發(fā)酵的典型黃色，觀察發(fā)酵過程，在第2 d即可明顯看到大量里氏木霉菌體，同時觀察到秸稈段斷裂、變?。辉诎l(fā)酵第5 d時，發(fā)酵液中已看不到成形的秸稈，而未處理秸稈幾乎無變化。對圖8中兩種發(fā)酵液，取發(fā)酵液測酶活，測得預處理秸稈發(fā)酵液中FPA酶活為0.522 IU/mL，未處理秸稈發(fā)酵液中未檢測到FPA酶活。

圖8 未處理(左)和預處理秸稈(右)接種里氏木霉發(fā)酵5 dFig.8 Untreated (left) and pretreated straw (right) were inoculated with Trichoderma reesei for 5 days

4 討論

水稻秸稈全球產(chǎn)量大，又需要合理利用，是重要的生物質(zhì)資源，但由于其獨特的結(jié)構(gòu)，難以直接利用，對于水稻秸稈的生物煉制來說，預處理是必不可少的一個環(huán)節(jié)。通過有效的預處理改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，使纖維素易被酶解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，進而轉(zhuǎn)化為更多的高值產(chǎn)品。預處理是木質(zhì)纖維素生物煉制中成本最高的一步操作，通過研發(fā)、技術(shù)的改進，預處理成本的降低還有很大的空間[21]。

通過試驗和結(jié)合文獻發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，溫度、時間和濃度對水稻秸稈預處理的影響都是正向貢獻的，是從三個維度上的強度積累，且都積累于打破秸稈結(jié)構(gòu)上。在這三個因素中，時間是對另外兩個因素的完全積累作用，溫度和濃度對預處理的積累作用是既有交互又有獨立的。因此，預處理對秸稈的影響的強度積累必然存在“閾值”，這個閾值很難直接找到，通常間接表現(xiàn)為一些觀測值，例如秸稈的物理性質(zhì)、化學性質(zhì)、試驗響應值等。閾值源于整個預處理過程中所有影響因素的共同積累，因此可以表現(xiàn)成多個點。在試驗過程中可以根據(jù)單因素、正交、響應面等試驗方法尋找這些閥值的簡化表現(xiàn)點，然后根據(jù)具體情況選擇我們需要的點，并做出適當優(yōu)化，得到好的預處理方案。

本試驗以常溫常壓低濃度，不需要減小秸稈的粒度的預處理思路出發(fā)，采用單因素和響應面法探究水稻秸稈的堿處理條件，以秸稈保留量(g/g)，預處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)、初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)為評估指標。不同試劑的單因素實驗顯示，NaOH對水稻秸稈的預處理效果最好，處理條件各因素對其影響主次為:濃度>溫度>時間，響應面實驗也驗證了這一點。通過響應面確定了最佳預處理條件為溫度55 ℃、時間30 h、濃度1.3%。對預處理后的水稻秸稈進行掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察和紅外光譜分析都表明預處理打破了水稻秸稈的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，使其更容易被纖維素酶吸附、酶解。對預處理后的水稻秸稈用里氏木霉進行發(fā)酵，里氏木霉生長良好，在發(fā)酵5 d測得FPA酶活為0.522 IU/mL，而未處理的秸稈完全不能被微生物利用。經(jīng)過預處理的水稻秸稈具有一定的生物煉制潛力，可以通過微生物發(fā)酵制備燃料乙醇、丁醇、秸稈飼料等。