全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜解析黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒揮發(fā)性組分特征揮發(fā)性化合物

田欣，祁新春，張澤，繆成鵬，徐巖，唐柯*

1(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122) 4(山西戎子酒莊有限公司，山西 臨汾，041000)

葡萄酒是世界上最流行的酒精飲料之一，葡萄酒的香氣反應(yīng)了一款葡萄酒的品種、產(chǎn)地、釀造工藝等，其決定著葡萄酒的風(fēng)味和典型性[1]，是葡萄酒品質(zhì)評價中最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一，也是消費者選擇葡萄酒的重要因素之一，所以葡萄酒香氣的研究對于提高葡萄酒的品質(zhì)和產(chǎn)區(qū)典型性都具有重要意義。中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，涌現(xiàn)出很多優(yōu)質(zhì)的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，其中黃土高原產(chǎn)區(qū)是我國近年來一個新興的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)具備葡萄栽培獨特的氣候和地域特點，為釀酒葡萄的生長提供了得天獨厚的風(fēng)土條件[2]，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前對于該產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)味特征及揮發(fā)性化合物的研究已經(jīng)逐漸開始展開[3-5]。

近年來國內(nèi)對于不同產(chǎn)區(qū)不同品種的葡萄酒的香氣研究已經(jīng)非常廣泛，但是對于葡萄酒揮發(fā)性成分的檢測分析主要基于一維氣相色譜技術(shù)。李佳等[6]通過GC-MS對昌黎地區(qū)的赤霞珠葡萄酒的香氣成分進行了解析，共鑒定出36種香氣物質(zhì)，其中醇類占香氣成分的一半以上，賦予葡萄酒產(chǎn)區(qū)特性，并且甲氧基異戊酸乙酯、3-甲氧基癸酸乙酯等化合物也可能為特征香氣成分；宋慧麗等[7]通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜技術(shù)(headspace solid-phase microextraction combined-compre-hensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)共檢測出河西走廊赤霞珠原汁和酒中130種香氣化合物；侯敏[8]運用了感官分析與儀器分析(GC-MS)相結(jié)合的手段明確了沙城產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒香氣特征描述詞和83種關(guān)鍵香氣化合物；王蓓等[9]采用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SBSE-GC-MS),對我國威代爾冰葡萄酒的揮發(fā)性成分進行檢測分析，共定性出109種揮發(fā)性成分；左俊偉等[10]同樣采用了HS-SPME-GC-MS對寧夏產(chǎn)區(qū)霞多麗和貴人香干白葡萄酒的香氣物質(zhì)進行檢測，共定性得到49種香氣物質(zhì)，并明確了果香特征的主要貢獻化合物。這些研究豐富了對我國葡萄酒風(fēng)味化學(xué)的認識并對進一步的香氣特征的探究奠定了基礎(chǔ)。

但是葡萄酒中香氣成分較多且復(fù)雜，通過一維氣相色譜技術(shù)進行檢測會出現(xiàn)化合物共流出的現(xiàn)象，影響了定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，而全二維氣相色譜的出現(xiàn)較好的改善了該問題。這項技術(shù)發(fā)明于上世紀九十年代，其利用兩根性質(zhì)不同的色譜柱，將第一維氣象色譜柱分離出的組分的流出到第二維氣相色譜柱(兩次分離的色譜柱性質(zhì)不同)中進行再次分離，從而極大提高峰容量和分辨率，同時也提高靈敏度[11]。從而相對一維氣相色譜技術(shù)，較好的改善了共流出的現(xiàn)象。目前國外已經(jīng)將全二維色譜技術(shù)廣泛用于葡萄酒香氣的研究中，WELDEGERGIS等[12]采用全二維飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(GC×GC-TOFMS)對南非皮諾塔基葡萄酒的揮發(fā)性化合物進行了全面的檢測，共定性得到206種化合物；WELKE等[13]采用GC×GC-TOFMS對巴西霞多麗葡萄酒進行了定性和定量分析；NICOLLI等[14]則通過感官分析、GC-O和GC×GC-TOFMS分析了不同葡萄園管理手段對葡萄酒香氣的影響。

目前全二維氣相色譜技術(shù)在我國已經(jīng)應(yīng)用于白酒[15]、茶[16]、調(diào)料[17]等食品的檢測分析中，而在葡萄酒香氣物質(zhì)的研究中還鮮有報道，因此本研究采用GC×GC-TOFMS對黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中揮發(fā)性成分進行鑒定，以期探討全二維氣相色譜技術(shù)在葡萄酒香氣分析中的應(yīng)用，同時也為深入探究黃土高原產(chǎn)區(qū)葡萄酒的風(fēng)味特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5款赤霞珠干紅葡萄酒分別來自黃土高原產(chǎn)區(qū)五個小產(chǎn)區(qū)(馱腰坡、大石頭、十里鋪、南頭、東廒)，均由山西戎子酒莊提供；NaCl(分析純)，上海國藥集團；C5-C30 烷烴標(biāo)樣(色譜純),天津光復(fù)精細化工研究所。具體信息見表1。

表1 赤霞珠干紅葡萄酒樣品信息Table 1 Cabernet Sauvignon dry red wine sample information

1.2 儀器與設(shè)備

全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)由Agilent 7890N氣相色譜(美國Agilent公司)，KT-2001冷噴調(diào)制器(美國Zoex公司)和Pegasus 4D飛行時間質(zhì)譜儀(美國Leco公司)組成；2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，美國Supelco公司；MPS多功能自動進樣器，德國Gerstel公司；DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；Rxi-17Sil MS(1.1 m×0.25mm ID，0.25 μm)，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)

取8 mL葡萄酒樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，加入3 g氯化鈉。萃取溫度 50 ℃，樣品平衡 5 min，萃取 45 min，轉(zhuǎn)速為 250 r/min。萃取結(jié)束后進樣，萃取頭在GC進樣口(250 ℃)解析附5 min。

1.3.2 全二維飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)儀器條件

氣相色譜條件：色譜柱：一維色譜柱DB-FFAP，二維色譜柱Rxi-17Sil MS。色譜條件：進樣口溫度 250 ℃，以不分流模式進樣。一維柱溫箱升溫程序：起始溫度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min 的速率升溫至 230 ℃并保持 15 min。調(diào)制器調(diào)制時間4 s，熱調(diào)制時間為 1 s，調(diào)制補償溫度為 20 ℃。二維柱溫箱升溫程序：起始溫度 40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。以高純氦氣(>99.999 5%)作為載氣，恒流模式，流速：1 mL/min。

飛行時間質(zhì)譜條件：采用EI離子源，離子源溫度 230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制 70 eV。檢測器采集質(zhì)量數(shù)范圍35～400 amu，采集頻率 100 spectrum/s，電壓控制1 430 V。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由LECO公司Pegasus 4D工作站采集，通過儀器自帶的ChormaTOF軟件對數(shù)據(jù)進行分析，其中色譜峰的峰寬分別設(shè)為24 s和0.2 s，自動識別信噪比大于200的色譜峰后進行自動積分解卷積和質(zhì)譜庫(mainlib，Wiley 9和replib)比對，進一步通過保留指數(shù)(保留指數(shù)根據(jù)C5-C30計算得出)定性，選擇相似度及反相似度不小于700的化合物作為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃土高原赤霞珠葡萄酒揮發(fā)性化合物分離特性解析

由于葡萄酒香氣組成和基質(zhì)十分復(fù)雜，采用一維氣相色譜技術(shù)進行分離檢測尚存在峰容量不足、共流出、靈敏性低等問題，從而影響最終定性的結(jié)果或無法鑒定出一些關(guān)鍵化合物，遠遠無法滿足目前我們對于葡萄酒風(fēng)味化學(xué)研究的需要。全二維氣相色譜技術(shù)的出現(xiàn)，為更好的分離鑒定這些復(fù)雜的組分提供了有力的工具。全二維氣相色譜具有分離能力強、峰容量大、選擇性高的特點，與飛行時間質(zhì)譜的連用更好的提高了其靈敏性，從而可以檢測到更多痕量物質(zhì)，豐富對風(fēng)味化學(xué)研究的認識[11]。

由圖1可見，一維色譜圖中存在大量化合物共流出的現(xiàn)象，在同一個一維時間點上，存在多個物質(zhì)。而進一步采用二維色譜分離，這些共流出的化合物在二維色譜上得到了較好的分離，二維色譜具有強大的分離能力，可以更好的進行復(fù)雜組分的分離鑒定。

圖1 黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒1D總離子流色譜圖(a)及2D總離子流色譜圖(b)Fig.1 GC × GC-TOFMS total 1D (a) and 2D (b) ion chromatogram of volatile compounds of Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

在全二維色譜分離中，由于采用性質(zhì)不同的兩種色譜柱進行分離，其具有相同結(jié)構(gòu)的化合物在譜圖上分布具有規(guī)律性的特點，同系物呈現(xiàn)線性分布[15,18]，可以為葡萄酒中香氣化合物的定性提供依據(jù)，從而提高鑒定結(jié)果的可靠性。在GC-O結(jié)合一維氣相色譜對具有香氣貢獻的化合物進行鑒定的過程中，由于共流出及靈敏性等問題，使一些關(guān)鍵化合物不能被很好的鑒定出來,在結(jié)果中存在一些未知物質(zhì)，前期席艷茹等[19]采用GC-O-MS對來自黃土高原產(chǎn)區(qū)的兩個小產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒進行分離，但仍有一些重要的的香氣貢獻物質(zhì)無法被定性，而在對鎮(zhèn)江陳醋的研究中，研究人員將GC-O與全二維技術(shù)結(jié)合使用[20]，便可以較好的對關(guān)鍵化合物進行高效的鑒定。與前期對于該產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒揮發(fā)物質(zhì)的研究相比，蔣寶等[21]采用HS-SPME結(jié)合一維氣相色譜技術(shù)(GC-MS)對黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒進行檢測鑒定，共鑒定到45種香氣化合物，而通過GC×GC-TOFMS進行分離鑒定一共可以鑒定到600種化合物，而在每個小產(chǎn)區(qū)的酒中也可以定性到400種左右化合物(見表2)，相對一維具有明顯的優(yōu)勢，特別是具有較高的靈敏性，可以鑒定到一些痕量化合物，從而豐富我們對葡萄酒風(fēng)味化學(xué)的認識，也為進一步探究產(chǎn)區(qū)特性提供基礎(chǔ)。

表2 黃土高原赤霞珠葡萄酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定化合物統(tǒng)計Table 2 Volatile compounds identified in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

2.2 黃土高原赤霞珠葡萄酒揮發(fā)性化合物分析

通過全二維氣相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒揮發(fā)性組分進行檢測，通過Pegasus 4D工作站對質(zhì)譜庫的檢索結(jié)合保留指數(shù)比對，共定性得到600個化合物，其中以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主，分別定性到128種、113種、85種和83種化合物。該結(jié)果同赤霞珠葡萄酒風(fēng)味化合物的研究具有一致性[22-23]。

在黃土高原產(chǎn)區(qū)中，來自不同的小產(chǎn)區(qū)中定性到的化合物總數(shù)相差不大分別，其中來自大石頭產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒定性到430種化合物、十里鋪產(chǎn)區(qū)定性到407種，南頭產(chǎn)區(qū)定性到392種，東廒產(chǎn)區(qū)定性到415種以及在馱腰坡產(chǎn)區(qū)定性到396種化合物。而對比不同小產(chǎn)區(qū)中類別的數(shù)量，與整體情況一致，都以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主且小產(chǎn)區(qū)間相差不大，該結(jié)果說明產(chǎn)區(qū)間具有較好的一致性，從而具有共有的產(chǎn)區(qū)特征性。

在鑒定的化合物中，酯類物質(zhì)的數(shù)目最多，占整體數(shù)目的21.33%，酯類是葡萄酒中含量最多的一類物質(zhì)，酯類化合物是一種良好的風(fēng)味物質(zhì)，大多呈現(xiàn)果香類的香氣特征。如乙酸異戊酯、異戊酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯以及蘋果酸二乙酯等，其具有蘋果、香蕉、椰子和桃李等水果香。此外，一些短鏈酯主要產(chǎn)生果香、花香等香氣，是葡萄酒中清新果香的主要來源，而一些長鏈酯則產(chǎn)生類似堅果、蜂蜜和油脂的香氣，為葡萄酒帶來更為厚重的香氣特征，增加葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性[24]。

芳香族化合物占18.83%，芳香族化合物主要來源于原料中芳香族氨基酸的分解代謝，為酒的風(fēng)味帶來一些花香、香料類的香氣，從而增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，如苯甲醇、苯乙醇為葡萄酒帶來類似玫瑰的香氣，而肉桂酸乙酯、香草醛等則為葡萄酒貢獻了類似香料、煙熏的香氣特征。

醇類化合物也是風(fēng)味物質(zhì)中重要的一類芳香物質(zhì)，本研究共檢測到83種，占總量的13.83%，其與酯類物質(zhì)共同奠定了葡萄酒中的水果香氣和清香的基調(diào)，其中順-3-己烯醇、反-2-己烯醇等為葡萄酒貢獻了青草類的清香。

醛酮類化合物共檢測到74種，占總物質(zhì)的12.33%，其中醛類物質(zhì)為酒帶來一些植物類和油脂的香氣，如己醛、反-2-甲基-2-丁烯醛、壬醛等，而酮類則主要是一些奶香和堅果類的香氣特征，如2,3-丁二酮等。

含硫化合物也是葡萄酒中關(guān)鍵的一類香氣化合物，由于其閾值較低，且具有獨特的香氣特征，雖然目前認為其主要是一些不良氣味的來源，但其對葡萄酒整體風(fēng)味具有較大的影響，目前同樣是葡萄酒風(fēng)味研究的熱點之一[25]。在黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中共檢測到25種含硫化合物，占總體數(shù)目的4.17%。其中2-甲基噻吩等物質(zhì)具有肉類的香氣特征[26]，3-甲硫基丙醇具有煮土豆的香氣特征，是威代爾冰酒中的關(guān)鍵化合物[27]，這些含硫化合物均為葡萄酒增添了香氣的復(fù)雜性。

此外，萜烯類化合物也是葡萄酒中重要的一類化合物，是葡萄酒品種香的重要來源[28]，具有清香的植物或水果和花香的香氣，并且很多萜烯類物質(zhì)具有重要的生理活性，一直是葡萄酒風(fēng)味研究中的熱點。在黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒樣品中共定性到85種萜烯類化合物，占總體的14.17%(表3)。之前蔣寶[21]等人只在黃土高原產(chǎn)區(qū)新釀赤霞珠葡萄酒中檢測到1種萜烯類化合物。而席艷茹等[29]人結(jié)合GC-O在2013年黃土高原5個小產(chǎn)區(qū)新釀赤霞珠葡萄酒中共定性到8種具有香氣貢獻的萜烯類化合物。相比一維的檢測，通過GC×GC-TOFMS可以更加有效對痕量萜烯類化合物進行檢測，并且可以很好的對同分異構(gòu)體進行鑒定，如E-羅勒烯和Z-羅勒烯。萜烯類化合物主要為葡萄酒的風(fēng)味貢獻植物類和花香類的特征，如1,4-桉葉素和1,8-桉葉素是澳大利亞赤霞珠葡萄酒中典型的桉樹香氣的貢獻化合物[30]，γ-萜品烯、α-雪松烯、1-萜品醇、4-萜品醇等主要呈現(xiàn)生青、松葉類的香氣特征，異香葉醇、香茅醇、β-大馬酮、α-紫羅蘭酮等則為葡萄酒貢獻玫瑰、紫羅蘭等花香類的香氣特征，這些為葡萄酒的風(fēng)味帶來清新清甜的植物香氣和復(fù)雜性。

表3 黃土高原赤霞珠葡萄酒中萜烯類化合物Table 3 Terpenes in Cabernet Sauvignon dry red wine from Loess Plateau

續(xù)表3

序號名稱CAS1RT/s2RT/s保留指數(shù)a參考保留指數(shù)b相似性反相似性可能性14異松油烯586-62-910242.761283.41280918932167415順式玫瑰氧化物876-17-511722.511357.31358862872264416(-)-玫瑰醚16409-43-111722.511357.31390859919359817反式玫瑰醚876-18-612002.611371.31365716885564818α-側(cè)柏酮546-80-513162.3314311438798819160419α-環(huán)檸檬醛432-24-613482.41448.11430831837377520順式-里那醇氧化物5989-33-313961.991473.41478908920375821順式-對薄荷烷-3-酮491-07-613962.491473.71465753775303222反式-里那醇氧化物34995-77-213961.981473.41452912919376723橙花醇氧化物1786-08-914002.361475.71500878880920424茶香螺烷36431-72-814643.171510.41523882915886825(1S)-(-)-樟腦464-48-215002.41529.61532865881559926葡萄螺烷65416-59-315122.941536.415279089317429271-(1,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮43219-68-715202.321540.41504727775832528里那醇78-70-615281.81544.51552960960642329α-雪松烯469-61-415843.621575.91571812871237530(-)-異胡薄荷醇89-79-215882.011577.215757118092905311-萜品醇586-82-315881.941577.11582905907570532小茴香醇1632-73-116041.861585.815978778848673334-萜品醇562-74-316402.081605.71612943944777134脫氫芳樟醇29957-43-516481.731610.11613766855568535反式-依杜蘭41678-29-916562.81615.216027498223829362-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)丙醛29548-14-916802.191628.61620810823271937β-環(huán)檸檬醛432-25-716882.361633.21622919926866438β-萜品醇138-87-416881.881632.91641861877553439乙酸反式里那醇氧化物酯56752-50-217002.3616401619760797725940γ-松油醇21129-27-117041.9116421621964966197641反式羅勒烯醇7643-60-917201.7816511650776829275342羅勒烯醇5986-38-917201.7816511688732840234543藏紅花醛116-26-717322.221658.11617903911854844乙酸香茅酯150-84-517402.421662.71662840872423645順α-法呢烯28973-97-917442.911665.31657909926405046(E)-β-法呢烯18794-84-817482.891667.61662899918378847異龍腦醇124-76-517561.91671.51670736792286848(-)-龍腦醇464-45-918161.8617061675794842316249β-紅沒藥烯495-61-418563.061731.11738905906422650水芹醛21391-98-018682.317381710838930725851環(huán)氧芳樟醇14049-11-718721.781740.11721731755736852反式吡喃里那醇氧化物39028-58-518721.781740.11724704794726153α-金合歡烯502-61-418882.851750.51745905925713154香茅醇106-22-919121.761764.51771921934441455α-姜黃烯644-30-419362.81779.81773895906853756γ-異香葉醇13066-51-819481.751786.418008909028984572-蒎烯-10-醇515-00-419681.791798.71767773812534258橙花醇106-25-219721.751801.11806891903394059異香葉醇5944-20-719921.751813.61820872875593660β-大馬酮23726-93-420242.3618341830921922804061順式-香葦醇1197-06-420321.771838.61866717757572762反式香芹醇1197-07-520361.781841.11836730791447563菖蒲烯483-77-2204031844.41840823855570364α,β-二氫-β-紫羅蘭酮17283-81-720402.4618441854791829605865香葉醇106-24-120441.751846.11853916917339066香葉基丙酮3796-70-120682.341861.518628969066042

續(xù)表3

注：a，保留指數(shù)根據(jù)C5-C30正構(gòu)烷烴計算得出；b，數(shù)據(jù)來源于NIST數(shù)據(jù)庫。

研究還檢測到呋喃、內(nèi)酯、吡嗪等化合物，與上述物質(zhì)共同組成了黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒的香氣特征。

3 結(jié)論

本研究采用全二維氣相色譜結(jié)合飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)技術(shù)對黃土高原5個小產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒中揮發(fā)性組分進行了全面解析。研究發(fā)現(xiàn)采用全二維色譜技術(shù)結(jié)合飛行時間質(zhì)譜具有強分離能力和靈敏性，可以更有效的對復(fù)雜組分進行分析，較好的解決了一維氣相色譜中共流出和無法檢測到一些痕量物質(zhì)的問題。通過對質(zhì)譜庫的檢索及保留指數(shù)比對，在黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中共鑒定出600種香氣化合物，體現(xiàn)了葡萄酒香氣成分的復(fù)雜性。其中揮發(fā)性組分以酯類、芳香族、萜烯類和醇類為主，此外還有醛酮類、含硫化合物、呋喃、內(nèi)酯、吡嗪等化合物，這些物質(zhì)共同作用形成了該產(chǎn)區(qū)葡萄酒的風(fēng)味特征。但本研究只是對黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中的化合物進行了鑒定分析，而其對葡萄酒風(fēng)味的貢獻還與其含量和閾值等有較大關(guān)系，同時本研究檢測到了數(shù)量眾多的萜烯類化合物和硫化物，這些化合物對于黃土高原產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒獨特的風(fēng)味貢獻均值得進一步探究。