伯氏疏螺旋體補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子捕獲表面蛋白介導(dǎo)其補(bǔ)體逃逸機(jī)制的研究進(jìn)展

陳泰桂，羅麗莎，李連保，計(jì)震華，簡苗苗，丁喆，寶福凱，4，5，6#，柳愛華，3，5，6#

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué) 云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2. 昆明醫(yī)科大學(xué) 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，昆明 650500；3. 昆明醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，昆明 650500； 4. 昆明市兒童醫(yī)院 云南省兒童重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650300；5. 昆明醫(yī)科大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，昆明 650500；6. 云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，昆明 650500)

萊姆病(Lyme disease，LD)是一種由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)感染引起的自然疫源性疾病，于1976年在美國康涅狄格州萊姆鎮(zhèn)被發(fā)現(xiàn)，由Steere等[1]于1977年首次報(bào)道，是最常見的蜱傳播疾病之一。LD分布廣泛，于1992年被世界衛(wèi)生組織列入重點(diǎn)防治研究對象。目前世界范圍內(nèi)已有八十多個(gè)國家報(bào)告LD的存在，美洲、亞洲、北非、歐洲均有人群感染，且蜱所致人患LD呈現(xiàn)出區(qū)域擴(kuò)展趨勢[2，3]。近年來，關(guān)于LD免疫反應(yīng)方面的研究在動(dòng)物模型上取得了一系列突破性進(jìn)展。新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)也徹底改變了LD致病機(jī)制的研究方式。然而，人們對伯氏疏螺旋體如何從蜱傳播到哺乳動(dòng)物并維持其傳播過程仍然知之甚少[4]。

伯氏疏螺旋體作為LD的病原體，它利用多種策略感染宿主，并克服宿主的固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[5]。其中，補(bǔ)體系統(tǒng)是伯氏疏螺旋體必須克服以建立哺乳動(dòng)物宿主感染的主要固有免疫防御機(jī)制[6]。許多病原體在感染哺乳動(dòng)物宿主時(shí)具有自身進(jìn)化機(jī)制，常見機(jī)制是在其表面捕獲宿主補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑，這可以幫助它們在感染宿主時(shí)逃避其補(bǔ)體激活與殺傷作用[7]。體外培養(yǎng)伯氏疏螺旋體分離株的研究顯示，它在人血清中的存活能力與其表面的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子捕獲表面蛋白(complement regulator-acquiring surface protein，CRASP)的表達(dá)量相關(guān)，該蛋白通過與補(bǔ)體調(diào)節(jié)H因子(foctor H, FH)家族的一種或多種宿主蛋白結(jié)合使伯氏疏螺旋體能夠抑制旁路途徑激活并阻止細(xì)胞表面形成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，輔助伯氏疏螺旋體逃避宿主的免疫殺傷[8-10]。

1 CRASP和FH

1.1 CRASP的特性及分類CRASP是定位于伯氏疏螺旋體表面幾種不同脂蛋白的統(tǒng)稱，可以與宿主FH家族的一種或多種蛋白結(jié)合。迄今為止，通過伯氏疏螺旋體抗血清鑒定出5種CRASP，分別為： CRASP-1、CRASP-2、CRASP-3、CRASP-4和CRASP-5[6，11-12](表1)。

不同的CRASP會(huì)在伯氏疏螺旋體感染周期中不同階段表達(dá)。CRASP-1僅在伯氏疏螺旋體從蜱傳播到宿主又從宿主回到蜱體內(nèi)的階段表達(dá)[13]。CRASP-2在哺乳動(dòng)物感染期間表達(dá)，但它不是哺乳動(dòng)物發(fā)生感染所必需的[12]。CRASP-3、CRASP-4、CRASP-5在哺乳動(dòng)物感染期間表達(dá)，在蜱定植期間受到較大程度的抑制[14]。CRASP-3可以與CRASP-1和(或)CRASP-2協(xié)同作用，以幫助伯氏疏螺旋體逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用[15]。

表1 伯氏疏螺旋體CRASP的分類

1.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的激活途徑在伯氏疏螺旋體傳播期間，宿主免疫系統(tǒng)試圖通過補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用、吞噬作用和細(xì)胞免疫作用清除病原體。補(bǔ)體系統(tǒng)由血漿和膜相關(guān)蛋白組成，是宿主固有免疫防御機(jī)制之一。宿主補(bǔ)體系統(tǒng)成分廣泛分布于體液中，可以多途徑激活并介導(dǎo)對感染的有效反應(yīng)。補(bǔ)體的激活可以通過3種不同的途徑：經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑[16-17]。補(bǔ)體主要通過以下方式引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)：(1)調(diào)理作用引發(fā)吞噬作用；(2)釋放趨化肽介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；(3)MAC裂解細(xì)胞。特定的適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生前，結(jié)合于病原體表面的C3可以自發(fā)激活旁路途徑，觸發(fā)一系列酶促事件，導(dǎo)致MAC的形成。

1.3 FH的結(jié)構(gòu)及特性FH及其補(bǔ)體調(diào)節(jié)H因子樣蛋白-1(factor H-like protein 1，F(xiàn)HL-1)是補(bǔ)體旁路途徑的主要調(diào)節(jié)蛋白。FH是一種相對分子質(zhì)量150 000的可溶性蛋白，由人體多種類型的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)產(chǎn)生。FH由20個(gè)補(bǔ)體控制蛋白(complement control protein，CCP)模塊組成，包含2個(gè)末端的C3b結(jié)合區(qū)和2個(gè)聚陰離子宿主標(biāo)志物結(jié)合區(qū)[18]。FHL-1是FH的可變剪接產(chǎn)物，F(xiàn)HL-1與FH的N末端共享配體結(jié)合區(qū)域和補(bǔ)體調(diào)節(jié)活性區(qū)域，但FHL-1僅含前7個(gè)CCP模塊和4個(gè)獨(dú)特氨基酸的羧基末端。因此，F(xiàn)HL-1含有N端FH調(diào)節(jié)位點(diǎn)和1個(gè)糖胺聚糖識別位點(diǎn)，但缺少C端C3b結(jié)合區(qū)和CCP19-20模塊[19]。

FH可作為I因子介導(dǎo)C3b降解的輔因子，裂解C3b導(dǎo)致其失活(輔助劑活性)；還可通過與B因子競爭性結(jié)合C3b調(diào)節(jié)旁路途徑中C3b轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)的形成[20]。并且FH還可以加速C3轉(zhuǎn)化酶的衰變，進(jìn)一步在C3b水平上控制補(bǔ)體激活[21-22]。FHL-1可在C3及上游水平抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活[23]。FH還可與宿主表面的聚陰離子宿主標(biāo)志物(如：唾液酸和糖胺聚糖)結(jié)合以抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，從而維持伯氏疏螺旋體免受補(bǔ)體系統(tǒng)攻擊的能力。

2 CRASP調(diào)節(jié)補(bǔ)體因子活性的機(jī)制

哺乳動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子以特定方式與不同補(bǔ)體成分相互作用，使其激活和抑制處于平衡狀態(tài)，既能防止對自身組織造成損傷，又能有效殺滅外來病原微生物。在免疫系統(tǒng)中，補(bǔ)體系統(tǒng)直接激活會(huì)使活化產(chǎn)物沉積形成MAC，在細(xì)胞膜中形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，以殺滅外來病原體[24]。因此，抵抗哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的清除能力是伯氏疏螺旋體在宿主中存活的重要環(huán)節(jié)。哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)許多病原體通過招募補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑的方式，實(shí)現(xiàn)逃避宿主補(bǔ)體的殺傷作用。

伯氏疏螺旋體采用的逃避策略主要為，在補(bǔ)體激活的旁路途徑中，通過CRASP在表面募集FH和FHL-1，抑制旁路途徑補(bǔ)體激活并阻止細(xì)胞表面形成MAC，幫助螺旋體逃避補(bǔ)體的殺傷作用[25]。這種補(bǔ)體逃逸機(jī)制對于伯氏疏螺旋體這類生長緩慢的病原體尤為重要。在CRASP的結(jié)合能力中，CRASP-1和CRASP-2結(jié)合FH和FHL-1，而FHL-1缺乏FH CCP-20模塊，故CRASP-3、CRASP-4和CRASP-5僅結(jié)合FH[26]。CRASP結(jié)合FH的過程中，每種CRASP的相對親和力隨補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子FH和FHL-1的變化而變化，并且FH會(huì)保持本身的活性構(gòu)象，使得其能正常發(fā)揮抑制補(bǔ)體活化的作用[27]。

3 CRASP與伯氏疏螺旋體致病的關(guān)系

伯氏疏螺旋體主要以脊椎動(dòng)物，如小型哺乳動(dòng)物或鳥類為宿主，以硬蜱屬蜱類為傳播媒介。由于伯氏疏螺旋體必須經(jīng)過蜱類叮咬動(dòng)物傳播，進(jìn)一步增加了伯氏疏螺旋體與蜱和脊椎動(dòng)物宿主之間相互作用的復(fù)雜性，使得其能適應(yīng)不同生存環(huán)境的挑戰(zhàn)[10]。伯氏疏螺旋體在從蜱傳播到哺乳動(dòng)物的過程中，所表達(dá)的外表面蛋白會(huì)隨所處環(huán)境的不同而不斷變化。幼蜱吸食已感染伯氏疏螺旋體的動(dòng)物血后感染伯氏疏螺旋體，隨后伯氏疏螺旋體上調(diào)外表面蛋白OspA和OspB，以幫助自身成功定植于蜱蟲體內(nèi)。為進(jìn)一步成功感染其他哺乳動(dòng)物宿主，伯氏疏螺旋體需從蜱的腸道遷移至蜱唾液腺，此時(shí)，OspA和OspB表達(dá)減少而OspC表達(dá)增加[28]。當(dāng)蜱蟲叮咬其他宿主時(shí)，將伯氏疏螺旋體傳播到宿主的血液和皮膚，伯氏疏螺旋體會(huì)擴(kuò)散至遠(yuǎn)處的組織中建立持續(xù)感染[29]。當(dāng)感染伯氏疏螺旋體的蜱吸食人類血液或組織液時(shí)，會(huì)將病原體傳播至人體內(nèi)，導(dǎo)致LD的發(fā)生。

在伯氏疏螺旋體感染宿主的進(jìn)化過程中CRASP對宿主體內(nèi)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白有很強(qiáng)的親和力和結(jié)合力，能有效支持伯氏疏螺旋體在多種哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。CRASP-1主要為伯氏疏螺旋體提供針對宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的抗性[30]。CRASP-2結(jié)合FH和FHL-1可保護(hù)伯氏疏螺旋體免受補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用，但也有研究表明，有的CRASP-2突變體對補(bǔ)體介導(dǎo)的體外殺傷作用不敏感，因此CRASP-2對于宿主中伯氏疏螺旋體持久存活不是必需的[31]。Erp蛋白(CRASP-3、CRASP-4、CRASP-5)在哺乳動(dòng)物感染期間產(chǎn)生，但在蜱定植期間受到很大抑制。雖然表達(dá)水平隨時(shí)間變化，但伯氏疏螺旋體在整個(gè)哺乳動(dòng)物感染過程中會(huì)不斷合成Erp蛋白[6]。有研究表明，Erp蛋白基因在伯氏疏螺旋體遇到哺乳動(dòng)物宿主血清的所有階段都會(huì)被轉(zhuǎn)錄[10]。在Erp蛋白家族中ErpP、ErpC和ErpA蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，共享約90%的氨基酸序列，但依賴于各自Erp蛋白的特異性識別基序，它們結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子(如FH和FHL-1)的能力有所不同，而這也成為伯氏疏螺旋體在特定宿主中存活的一個(gè)關(guān)鍵因素[32]。

2007年，Woodman等[33]研究中還發(fā)現(xiàn)，WT和FH缺陷型小鼠都可被伯氏疏螺旋體同等程度地感染，說明CRASP可能不是促成補(bǔ)體抗性和伯氏疏螺旋體成功感染哺乳動(dòng)物的唯一機(jī)制[10]。在伯氏疏螺旋體表面表達(dá)的CRASP存在著相互合作機(jī)制，其功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止結(jié)合FH，CRASP與FH或其他類似的宿主蛋白結(jié)合，可能還發(fā)揮其他功能，例如對宿主組織的黏附作用。因此，CRASP結(jié)合FH以逃避補(bǔ)體系統(tǒng)的殺傷作用，對于伯氏疏螺旋體有效感染哺乳動(dòng)物可能不是必需的。

4 結(jié)語

在伯氏疏螺旋體傳播期間，除了上文中提到的CRASP，伯氏疏螺旋體還可利用其他直接干擾不同補(bǔ)體成分的分子如BBK32、BGA66、BGA71和CD59樣蛋白或分子，結(jié)合FH、FHL-1、FH相關(guān)蛋白FHR-1、FHR-2或C4Bp等各種補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑間接抵抗補(bǔ)體系統(tǒng)激活，實(shí)現(xiàn)免疫補(bǔ)體逃逸。文章通過對補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子FH和FHL-1在伯氏疏螺旋體補(bǔ)體逃逸過程中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用概述，提高了對伯氏疏螺旋體逃逸免疫防御能力而存活機(jī)制的認(rèn)識，也為研究LD的發(fā)病機(jī)制開辟了一條新途徑。通過對伯氏疏螺旋體-補(bǔ)體系統(tǒng)-補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的聯(lián)合分析總結(jié)，可以更加深入了解LD的發(fā)病機(jī)制，為探索LD發(fā)病機(jī)制和防治提供科學(xué)依據(jù)和新思路。同時(shí)深入探究伯氏疏螺旋體補(bǔ)體抗性的其他機(jī)制，有助于進(jìn)一步開發(fā)直接靶向這些蛋白質(zhì)的有效疫苗。