卡介苗誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞訓(xùn)練免疫中的糖代謝重編程研究進(jìn)展

劉昀彤，丁茹，梁舒，馬小惠，鄧斐爾，宋田田，閆東梅

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，長春 130000)

隨著免疫細(xì)胞在活化和分化期間的代謝重編程過程被發(fā)現(xiàn)，“免疫代謝”這一概念被提了出來。糖代謝重編程通過多種機(jī)制調(diào)控免疫細(xì)胞的活化和功能，包括糖酵解關(guān)鍵酶的非代謝功能、代謝中間產(chǎn)物調(diào)控表觀遺傳修飾和信號傳導(dǎo)等。增強(qiáng)的糖酵解和谷氨酰胺驅(qū)動的三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)已被證明是卡介苗(bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的重要途徑，但這一過程在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)訓(xùn)練免疫中的具體機(jī)制尚不清楚。

1 BCG誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)生訓(xùn)練免疫

1.1 訓(xùn)練免疫一直以來，先天免疫系統(tǒng)被認(rèn)為沒有免疫記憶。然而，Netea等[1]基于BCG、β-葡聚糖等誘導(dǎo)先天免疫發(fā)揮非特異性保護(hù)作用的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物也存在先天免疫記憶，并將其稱為“訓(xùn)練免疫”，即先天免疫細(xì)胞在第1次接觸病原體時(shí)被訓(xùn)練，當(dāng)它們再次接受同一種或不同病原刺激時(shí)宿主表現(xiàn)出更高的反應(yīng)性和更強(qiáng)的抵抗力。訓(xùn)練免疫不針對特定病原體，而是主要依賴于表觀遺傳修飾介導(dǎo)的先天免疫細(xì)胞功能的長期激活，但這種狀態(tài)并不能永久維持[2]。

1.2 BCG通過訓(xùn)練單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)揮非特異性保護(hù)作用BCG是唯一被證明對結(jié)核病有效的疫苗，自1970年以來，BCG免疫療法成為了治療非肌肉浸潤性膀胱癌的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。大量臨床隨機(jī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BCG可以抵抗其他病原體的感染[4]，比如對人類皮膚利什曼病和瘧疾的非特異性作用[5]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料顯示，接種BCG可降低由非結(jié)核分枝桿菌引起的感染和死亡。來自小鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，BCG可以抵抗各種DNA和RNA病毒感染[6]。最近發(fā)現(xiàn)，BCG依靠訓(xùn)練免疫清除結(jié)核分枝桿菌[7]，而其發(fā)揮的非特異性保護(hù)作用也是由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的訓(xùn)練免疫所介導(dǎo)[8]。

接種BCG可改變?nèi)藛魏思?xì)胞的功能狀態(tài)，表現(xiàn)為二次刺激后表面活化標(biāo)志和細(xì)胞因子的上調(diào)，并證明發(fā)生在組蛋白的修飾是在轉(zhuǎn)錄水平對相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了長期調(diào)控。同時(shí)小鼠實(shí)驗(yàn)表明，BCG誘導(dǎo)的非特異性保護(hù)不依賴于T細(xì)胞和B細(xì)胞[9]。相關(guān)研究檢測了BCG誘導(dǎo)的體外人單核細(xì)胞全基因組的一項(xiàng)組蛋白修飾標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)除了炎癥相關(guān)基因，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/serine threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路在內(nèi)的多種信號通路的相關(guān)基因在表觀遺傳學(xué)水平被上調(diào)，這與β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫相似[10]。

1.2.1 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)與免疫代謝 目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞在極化的過程中有2個(gè)極端：M1型經(jīng)典途徑和M2型替代途徑，前者通常分泌炎性分子并發(fā)揮殺滅病原微生物和抗腫瘤的功能，后者則主要發(fā)揮抑炎作用，促進(jìn)損傷組織修復(fù)和纖維化以及腫瘤發(fā)展等病理過程[11]。隨著免疫細(xì)胞在活化和分化期間代謝重編程過程被發(fā)現(xiàn)，研究者提出了“免疫代謝”這一概念。研究表明，M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為糖酵解增強(qiáng)和乳酸產(chǎn)生增加，而M2型巨噬細(xì)胞似乎依賴于氧化磷酸化、脂肪酸攝取和β-氧化[12]。

1.2.2 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的訓(xùn)練機(jī)制 先天免疫細(xì)胞依靠表達(dá)多種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)及其組合將刺激信號傳入后，通過不同信號通路介入表觀遺傳機(jī)制，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，繼而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的生成，形成先天免疫記憶[13-14]，其中代謝相關(guān)信號通路以及代謝相關(guān)酶的基因在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)也是組蛋白表觀遺傳修飾的結(jié)果，這種免疫和代謝系統(tǒng)的長期訓(xùn)練起始于造血干細(xì)胞等前體細(xì)胞[15]。另外，某些代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)表觀遺傳酶的活性從而影響訓(xùn)練免疫[16]，因而代謝重編程與表觀遺傳修飾的相互作用是介導(dǎo)訓(xùn)練免疫的重要分子機(jī)制。表觀遺傳是指在一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等修飾作用導(dǎo)致的生物性狀產(chǎn)生可遺傳變異。通過各種表觀遺傳修飾的相互作用可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ的招募，從而介導(dǎo)了訓(xùn)練免疫中二次刺激后的快速轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄因子也反過來募集組蛋白修飾酶和染色質(zhì)重塑因子[2]。目前人們認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝重編程共同介導(dǎo)訓(xùn)練免疫[14]。

2 糖代謝重編程和訓(xùn)練免疫

Penkov等[17]認(rèn)為細(xì)胞代謝的變化可能遵從低等動物到哺乳動物的先天免疫記憶的祖?zhèn)髟瓌t。最近的研究表明，增強(qiáng)的糖酵解及由谷氨酰胺驅(qū)動的TCA循環(huán)已被證明是BCG和β-葡聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的重要代謝途徑[18-20]。

2.1 糖酵解正常哺乳動物細(xì)胞在有氧條件下，以葡萄糖氧化磷酸化途徑代謝產(chǎn)能；在缺氧條件下，分解葡萄糖生成的丙酮酸無法進(jìn)入TCA循環(huán)，而是轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)能效率遠(yuǎn)低于前者[21]。1927年，德國生化學(xué)家Warburg[22]發(fā)現(xiàn)，在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解同樣活躍，這種有氧糖酵解的代謝現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)。1970年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞也依賴于Warburg效應(yīng)[23]。

糖酵解中乳酸生成增多是訓(xùn)練免疫代謝的核心標(biāo)志之一[24]。BCG刺激單核細(xì)胞24 h后，乳酸生成量和葡萄糖消耗量均增加，且二者比值接近2，表明葡萄糖是乳酸的主要來源[19]，BCG誘導(dǎo)的單核細(xì)胞糖酵解和氧化磷酸化均增強(qiáng)，而不同的是，β-葡聚糖的作用結(jié)果被認(rèn)證是經(jīng)典的Warburg效應(yīng)，即糖酵解增強(qiáng)而氧化磷酸化減弱[18]。

BCG誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫依賴于Akt-mTOR途徑的糖代謝重編程，抑制這一信號通路或糖酵解限速酶以阻止糖代謝重編程都會逆轉(zhuǎn)訓(xùn)練免疫的訓(xùn)練效果，而在β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練模型中，表觀遺傳抑制劑也會抑制乳酸的產(chǎn)生[18]。這進(jìn)一步說明代謝重編程與表觀遺傳學(xué)是相互依賴的關(guān)系。糖酵解的核心地位還體現(xiàn)在限速酶在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平均上調(diào)，且通過對接種BCG的健康人外周血單核細(xì)胞中糖酵解限速酶的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)其顯著影響志愿者的訓(xùn)練免疫[19]。

2.1.1 糖酵解酶在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)揮非代謝作用 大量研究表示，增強(qiáng)的糖酵解除了提供能量和中間代謝產(chǎn)物，還能影響巨噬細(xì)胞的功能[25](表1)。如丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2， PKM2)二聚體可以易位至細(xì)胞核穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1-α)，從而調(diào)節(jié)HIF1-α靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。維持PKM2的高活性四聚體形式，將逆轉(zhuǎn)LPS的作用[26]。但糖酵解酶在訓(xùn)練免疫中是否發(fā)揮非代謝作用尚待研究。

表1 糖酵解相關(guān)酶對巨噬細(xì)胞功能的影響

2.1.2 誘導(dǎo)Warburg效應(yīng)的信號通路 研究證明，在BCG和β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫中，Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)組成的信號通路介導(dǎo)的高糖酵解速率具有關(guān)鍵的作用[19]，多種抑制劑對Akt/mTOR和糖酵解通量的抑制都削弱了單核細(xì)胞訓(xùn)練效果。敲除HIF1-α的小鼠完全失去了β-葡聚糖訓(xùn)練免疫，這證明HIF1-α介導(dǎo)的糖酵解對在體內(nèi)誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫是至關(guān)重要的[18]。

mTOR作為代謝環(huán)境的傳感器[36]，通過誘導(dǎo)下游HIF1-α、c-Myc(一種原癌基因)調(diào)節(jié)氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變，且直接調(diào)節(jié)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)中酶的表達(dá)。上游信號傳入時(shí)，HIF由α和β亞基組成異二聚體，HIF-α/β復(fù)合物易位至細(xì)胞核，與含有缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)靶基因的啟動子結(jié)合，從而啟動一系列糖代謝和免疫相關(guān)基因的表達(dá)[37]。

HIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要受α亞基穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，在靜息細(xì)胞中，HIF1-α被脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)羥基化而降解。缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子(factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH)通過羥基化阻斷其形成有效的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。PHD和FIH都需要O2和α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)作為底物和輔助因子。缺氧會抑制PHD而使HIF1-α積累，腫瘤細(xì)胞中原癌基因的突變等也會導(dǎo)致HIF1-α積累[38]。在LPS激活的巨噬細(xì)胞中，HIF1-α的穩(wěn)定性是由代謝中間體調(diào)節(jié)的，PHD活性依賴于α-KG，而富馬酸鹽和琥珀酸通過抑制PHD而使HIF穩(wěn)定表達(dá)[36]，線粒體產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)也可以上調(diào)HIF1-α的表達(dá)[38]。

2.2 磷酸戊糖途徑研究表明，糖酵解代謝的上調(diào)不僅為促炎型巨噬細(xì)胞提供ATP，而且還增強(qiáng)PPP。PPP通過產(chǎn)生氨基酸、核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)來支持炎癥反應(yīng)[25]。NADPH用于生產(chǎn)還原型谷胱甘肽以控制M1型巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平[39]。BCG刺激24 h后，核糖類物質(zhì)有所增加，說明BCG也誘導(dǎo)磷酸戊糖途徑的增強(qiáng)。β-葡聚糖誘導(dǎo)的PPP增強(qiáng)并不返回到糖酵解，6-氨基煙酰胺抑制PPP也并不會影響訓(xùn)練后細(xì)胞因子的增加，這表明PPP在β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫中的必要性遠(yuǎn)不如糖酵解[19-24]。

2.3 TCA循環(huán)BCG訓(xùn)練的單核細(xì)胞中谷氨酸和蘋果酸濃度升高，而富馬酸和乙酰輔酶A無變化，提示增強(qiáng)的谷氨酰胺代謝提高了TCA循環(huán)的通量，而抑制谷氨酰胺代謝會減弱BCG和β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫[19-24]，這似乎解釋了氧化磷酸化為何增強(qiáng)的原因。蘋果酸可以生成丙酮酸從而增加乳酸的產(chǎn)量，但已知乳酸的唯一來源是葡萄糖，所以谷氨酰胺代謝似乎并沒有參與到糖酵解中。另外，在抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅴ時(shí)，未觀察到明顯影響，而當(dāng)通過二氯乙酸使丙酮酸流入TCA循環(huán)時(shí)，訓(xùn)練的免疫力減弱。這表明，氧化磷酸化在BCG誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫中可能只與生物合成有關(guān)[19]。

LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為檸檬酸鹽和琥珀酸的積累[25]。檸檬酸鹽被證明是一種炎癥信號，其積累會產(chǎn)生3種重要的促炎介質(zhì)：NO、ROS和前列腺素。有研究發(fā)現(xiàn)，長期活化的單核細(xì)胞在低糖環(huán)境下會促進(jìn)檸檬酸外排來維持PPP提供不足的NADPH(圖1)，這一過程伴隨著蘋果酸的耗竭及檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼徇M(jìn)入谷氨酰胺代謝的過程[40]，這能否解釋BCG誘導(dǎo)谷氨酸和蘋果酸積累而乙酰輔酶A沒有大量產(chǎn)生，還需要進(jìn)一步研究。另外，BCG誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS增多，而β-葡聚糖訓(xùn)練后ROS卻減少，這是否暗示BCG相對β-葡聚糖的訓(xùn)練有更強(qiáng)的抗感染潛力也有待驗(yàn)證[41]。

β-葡聚糖也誘導(dǎo)谷氨酰胺代謝驅(qū)動TCA循環(huán)，實(shí)驗(yàn)證明谷氨酰胺代謝增加2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid，2-HG)、琥珀酸、富馬酸和蘋果酸的積累量，不參與丙酮酸和乳酸的生成，其中富馬酸被發(fā)現(xiàn)可以通過拮抗作用抑制組蛋白去甲基化從而誘導(dǎo)與β-葡聚糖誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫相類似的表觀遺傳修飾[20]。包括琥珀酸、2-HG、α-KG、富馬酸、乳酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)、乙酰輔酶A在內(nèi)的糖代謝中間產(chǎn)物均被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控表觀遺傳修飾，其中α-KG是去甲基化酶的輔助因子，富馬酸、琥珀酸、2-HG作為α-KG的拮抗劑則促進(jìn)組蛋白甲基化，而乙酰輔酶A和NAD分別是組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰酶的輔助因子[42]，這表明代謝物可以通過表觀遺傳機(jī)制影響訓(xùn)練免疫的狀態(tài)。

3 BCG在臨床治療中的前景

訓(xùn)練免疫可增強(qiáng)免疫功能從而治療疾病，如糾正腫瘤、各種病原感染和敗血癥中的免疫麻痹，但也可以促進(jìn)一些慢性代謝性炎癥疾病的持續(xù)發(fā)展。如DM患者持續(xù)的高血糖狀態(tài)可以訓(xùn)練巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶，繼而可能促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。

然而BCG誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫卻對DM患者有長遠(yuǎn)的治療效果。最近報(bào)道的Ⅰ期隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接受至少2次BCG接種的1型DM患者在大約3年后血糖恢復(fù)正常水平，其治療效果可持續(xù)5年以上。1型DM患者中高度活躍的氧化磷酸化導(dǎo)致葡萄糖利用不足，BCG通過激活有氧糖酵解，增加外周血細(xì)胞的葡萄糖消耗從而降低血糖，這種降血糖方式有效規(guī)避了胰島素帶來的低血糖風(fēng)險(xiǎn)。BCG的治療機(jī)制也可能部分依賴于TNF的表觀遺傳激活Treg和選擇性誘導(dǎo)攻擊胰島細(xì)胞的CTL死亡，從而改善自身免疫狀態(tài)[43]。此外，BCG可以降低小鼠血漿膽固醇水平并延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程[44]。

注：PFK-1，6-磷酸果糖激酶 1(phosphofructokinase 1)；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)；LDH，乳酸鹽脫氫酶(lactic dehydrogenase)；NADP,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)；PYC，丙酮酸載體(pyruvic acid carrier)；PDH，丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)；DIC，二羧酸鹽載體(dicarboxylate carrier)；CIC，檸檬酸載體(citric acid carrier)；IDH，異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase)；MDH，蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase)；SDH，琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)；IRG1，免疫應(yīng)答基因1(immune-responsive gene 1)；*標(biāo)注的是BCG誘導(dǎo)后上調(diào)的代謝物。圖1 BCG在巨噬細(xì)胞中參與糖代謝途徑示意

BCG誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫和糖代謝重編程對各種病原感染、腫瘤、敗血癥和一些慢性代謝性炎癥疾病表現(xiàn)出有益的作用。那么如何利用代謝組學(xué)技術(shù)和表觀遺傳學(xué)技術(shù)尋找治療慢性炎癥疾病的新靶點(diǎn)，如何最大化利用疫苗或其他刺激物誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫發(fā)揮非特異性保護(hù)作用將是未來的研究方向之一。