紫杉醇聯(lián)合他莫昔芬對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用

姜曉曄，姜婷婷，李冉，王璇，孫世猷，程序

(1.武漢城市學(xué)院 醫(yī)學(xué)部，武漢 430083；2.武漢市第四醫(yī)院 心血管內(nèi)二科，武漢 430000；3.燕山大學(xué) 校醫(yī)院，秦皇島 066000)

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占各類惡性腫瘤的7%，抗雌激素藥物他莫昔芬是預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)和擴(kuò)散的一線藥物[1]。然而，患者對(duì)他莫昔芬的耐藥限制了其使用，大約50%長(zhǎng)期使用他莫昔芬的乳腺癌患者產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[2-4]。聯(lián)合用藥可減少他莫昔芬藥量，降低繼發(fā)性耐藥率，同時(shí)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[5-6]。研究證實(shí)，他莫昔芬與抗腫瘤成分白藜蘆醇聯(lián)合使用可明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性[7]。

紫杉醇也是重要的天然抗腫瘤成分之一，通過(guò)抑制微管蛋白解聚將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，最終導(dǎo)致其凋亡[8]。紫杉醇聯(lián)合他莫昔芬對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。該研究探索這2種藥物是否具有抗MCF-7細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)，以期為兩者聯(lián)合應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)液、FCS和胰蛋白酶，購(gòu)自Gibco公司；MTT試劑，購(gòu)自Biosharp公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anne-xin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡試劑盒，購(gòu)自BD公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗，購(gòu)自CST公司；0.22 μm PVDF膜，購(gòu)自Biosharp公司；青霉素-鏈霉素溶液、Hoechst 33258染色液、DMSO、雙染蛋白marker和顯影液，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；紫杉醇注射液，購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；他莫昔芬片劑，購(gòu)自阿斯利康投資(中國(guó))有限公司；CCL22、IL-10、TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 主要儀器化學(xué)發(fā)光成像儀、Western blotting電泳儀、垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽(Bio-Rad公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；FACScan流式細(xì)胞儀(BD公司)；倒置熒光顯微鏡IX73[奧林巴斯(中國(guó))有限公司]；CT14RD高速冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7置于含10% FCS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 紫杉醇、他莫昔芬單藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以2 000 個(gè)/孔密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后分別加入單藥，總體積200 μL/孔。紫杉醇組按濃度梯度分為2、5、10、25和50 ng/mL處理組，他莫昔芬組則分為6.25、12.5、25、50和100 μg/mL處理組，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。每個(gè)處理濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。

每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO振蕩15 min，檢測(cè)光密度D(490 nm)值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算2組MCF-7細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50， IC50)。對(duì)于后續(xù)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Western blotting及ELISA檢測(cè)均以他莫昔芬和紫杉醇IC50為用藥濃度。

增殖抑制率=[1-(D給藥后-D給藥前)/(D對(duì)照組-D對(duì)照本底)]×100%

1.3.3 紫杉醇與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以2 000 個(gè)/孔密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后加入藥物，使總體積為200 μL/孔。加入紫杉醇與他莫昔芬共同作用24 h，聯(lián)合用藥藥物濃度的選擇見參考文獻(xiàn)[9]，終濃度為紫杉醇IC50×1/8+他莫昔芬IC50×1/8，紫杉醇IC50×1/4+他莫昔芬IC50×1/4，紫杉醇IC50×1/2+他莫昔芬IC50×1/2，紫杉醇IC50×1+他莫昔芬IC50×1，紫杉醇IC50×2+他莫昔芬IC50×2。通過(guò)Chou-Talalay中效方程式為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的軟件CompuSyn完成統(tǒng)計(jì)分析。聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)>1提示藥物間為拮抗作用，CI=1示藥物間為相加作用，CI<1示藥物間為協(xié)同作用。

1.3.4 熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞凋亡情況 MCF-7細(xì)胞完全貼壁后分別加入3組藥物(紫杉醇、他莫昔芬和紫杉醇聯(lián)合他莫昔芬),對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。作用24 h后，收集各組約106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS漂洗2次。4%甲醛4 ℃固定細(xì)胞10 min后涂片，晾干。用5 mg/L Hoechst 33258染色液作用5～10 min，濾紙吸凈多余液體。熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞并攝片。

1.3.5 FACS檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞5×104個(gè)/組，分別按細(xì)胞凋亡(PI、Annexin Ⅴ-FITC雙染)和細(xì)胞周期(PI單染)試劑盒說(shuō)明書操作，F(xiàn)ACS檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況。

1.3.6 ELISA檢測(cè)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌 3組藥物作用細(xì)胞24 h后，取各組上清液按照ELISA說(shuō)明書檢測(cè)CCL22、IL-10、TGF-β1表達(dá)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取各組濃度。

1.3.7 Western blotting檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 超聲振蕩10～15 s裂解各組細(xì)胞，分別提取總蛋白。各取20 μL上清液，95～100 ℃熱處理5 min；置冰上冷卻后離心5 min，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉，加入一抗(抗β-actin、PCNA、Bcl-2、Bax，1∶1 000稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育，再加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h；ECL曝光成像，化學(xué)發(fā)光成像儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用MCF-7細(xì)胞在紫杉醇組、他莫昔芬組用藥24 h后的IC50分別為11.38 ng/mL和30.87 μg/mL。單用兩藥對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，具有濃度依賴性(圖1)。相較于單藥組，兩藥聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制增加顯著(均P<0.05，圖2)。CompuSyn軟件分析顯示兩藥聯(lián)合時(shí)，CI=0.79，呈協(xié)同作用。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，紫杉醇+他莫昔芬組相較于單藥組PCNA表達(dá)水平明顯降低(圖3)。

注：與紫杉醇和他莫昔芬聯(lián)合組相比，*P<0.05。圖2 各用藥組對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用

圖3 紫杉醇與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

2.2 熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞凋亡情況3組藥物作用于MCF-7細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，各給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)增多，且紫杉醇+他莫昔芬組較紫杉醇組、他莫昔芬組凋亡細(xì)胞數(shù)增多(圖4)。

2.3 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響紫杉醇及他莫昔芬按IC50作用于MCF-7細(xì)胞24 h后，經(jīng)Annexin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡試劑盒染色觀察到各組細(xì)胞凋亡率不同，對(duì)照組、紫杉醇組、他莫昔芬組及紫杉醇+他莫昔芬組凋亡率分別為(5.56±0.12)%、(15.51±2.34)%、(18.82±3.21)%和(25.24±2.28)%。紫杉醇+他莫昔芬組較單藥組細(xì)胞凋亡明顯增多(圖5)。細(xì)胞周期分析顯示，紫杉醇阻滯(50.18±1.56)%細(xì)胞于G0/G1期，他莫昔芬阻滯(49.26±2.17)%細(xì)胞于G0/G1期，而紫杉醇+他莫昔芬組阻滯(75.29±2.48)%細(xì)胞于G0/G1期，提示聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同作用阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖(圖6)。

注：白色箭頭表示凋亡細(xì)胞。圖4 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響(×200)

圖5 紫杉醇和他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

注：A. 各處理組MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期百分比； B. 各處理組MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期百分比定量結(jié)果。圖6 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2.4 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，他莫昔芬組、紫杉醇組和紫杉醇+他莫昔芬組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下降，Bax表達(dá)水平明顯升高，其中聯(lián)合用藥組相較于單藥組變化更明顯(圖7)。

2.5 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞CCL22、IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，他莫昔芬組、紫杉醇組和紫杉醇+他莫昔芬組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CCL22、IL-10、TGF-β1表達(dá)量均顯著下降，聯(lián)合用藥組顯著低于單藥組(均P<0.05，表1)。

圖7 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

表1 紫杉醇及他莫昔芬單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞CCL22、IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響

3 討論

我國(guó)乳腺癌發(fā)病率居女性腫瘤首位，其轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)也是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。服用他莫昔芬可使有乳腺癌家族史的女性罹患風(fēng)險(xiǎn)降低30%以上，并且也可有效降低患者的復(fù)發(fā)死亡風(fēng)險(xiǎn)[10]。因此，他莫昔芬已成為臨床上預(yù)防和治療乳腺癌的首選藥物。然而，約50%長(zhǎng)期使用他莫昔芬的乳腺癌患者產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。他莫昔芬的主要作用機(jī)制為與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER，阻斷雌激素作用于乳腺癌細(xì)胞的信號(hào)通路，抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖。而紫杉醇對(duì)多種腫瘤存在抑制作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，成為腫瘤化療藥物的首選。

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，他莫昔芬與紫杉醇單藥處理MCF-7細(xì)胞都可抑制其增殖，其PCNA蛋白表達(dá)量明顯減少。紫杉醇和他莫昔芬作用24 h后的IC50分別為11.38 ng/mL和30.87 μg/mL，兩藥聯(lián)合作用時(shí)CI<1，呈協(xié)同作用?？赡艿脑?yàn)椋鹤仙即即龠M(jìn)微管蛋白聚合形成微管，同時(shí)抑制已形成的微管解聚，從而抑制細(xì)胞分裂增殖，不僅限于抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞[8]；聯(lián)合用藥可打破他莫昔芬只抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖的局限，增加其療效。

研究結(jié)果表明，他莫昔芬與紫杉醇單藥都可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，可能機(jī)制是降低了乳腺癌細(xì)胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而下調(diào)了Bcl-2/Bax比值，促使腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。這與金偉[12]和高菲菲[13]的研究結(jié)果一致。他莫昔芬與紫杉醇聯(lián)合用藥時(shí)MCF-7細(xì)胞凋亡率可達(dá)(25.24±2.28)%，且與單藥比較Bax表達(dá)明顯上升、Bcl-2表達(dá)明顯下降。這表明他莫昔芬與紫杉醇發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用的重要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-15]。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌免疫調(diào)節(jié)因子IL-10和TGF-β1影響機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[16-18]。盡管腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中IL-10的主要來(lái)源，但乳腺癌MCF-7細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-10降低機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[19]。Li等[20]研究表明，乳腺癌組織中腫瘤源性CCL22和TGF-β1的相互作用可誘導(dǎo)Treg積聚，并參與Treg的組織浸潤(rùn)及趨化；Treg可能主要通過(guò)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的表達(dá)和受體與細(xì)胞因子的相互作用間接影響腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而影響乳腺癌的進(jìn)展。研究結(jié)果表明，與單藥組相比，紫杉醇與他莫昔芬聯(lián)合用藥下調(diào)了免疫調(diào)節(jié)因子IL-10、TGF-β1和CCL22的分泌。這提示紫杉醇與他莫昔芬聯(lián)合用藥可逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞引起的免疫抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤殺傷效果。該結(jié)論已得到Kassa等[21]的研究結(jié)果支持，他們證明紫杉醇通過(guò)下調(diào)TGF-β1的分泌發(fā)揮免疫佐劑作用。

綜上所述，紫杉醇聯(lián)合他莫昔芬可能通過(guò)下調(diào)免疫調(diào)節(jié)因子IL-10、TGF-β1和趨化因子CCL22的表達(dá)發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。