去異味蘿卜紅色素提取工藝

鄧仕彬，林國榮，林授鍇，潘夢柔

莆田學院環(huán)境與生物工程學院，枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點實驗室（莆田 351100）

蘿卜自古以來就有“小人參”的佳譽，是我國餐桌上的?？停鳛橐环N十字花科植物，在我國被廣泛種植，品種繁多。紅心蘿卜（Red radish，學名Raphanus sativusvar. Chinese red meat）是蘿卜品種之一，成本低，來源豐富，表皮呈紅色或綠色，果肉通紅，肉質(zhì)酥脆爽口，富含花青素，可用于提取營養(yǎng)價值高、安全系數(shù)大的天然蘿卜紅色素，逐漸取代合成色素[1]，被廣泛用于食品[2]、化妝品[3]和醫(yī)藥[4]等領(lǐng)域。但蘿卜紅色素提取過程中會破壞蘿卜組織，導致蘿卜中的硫苷被內(nèi)源黑芥子酶水解，形成有異味的小分子含硫化合物，從而使蘿卜紅色素產(chǎn)生強烈的刺激性氣味和臭味[5]。這些異味物質(zhì)包括異硫氰酸酯、硫氰酸酯、二氧化硫、硫化氫等，其中又以異硫氰酸酯為主要成分[6]。蘿卜紅色素異味的存在降低了產(chǎn)品品質(zhì)，嚴重制約了其在食品中的應用與發(fā)展。

目前國內(nèi)蘿卜紅色素脫味的生產(chǎn)方法主要是利用樹脂除去硫苷，集中于對蘿卜紅色素進行后期脫味處理[7]。但國際上對色素的生產(chǎn)手段有嚴格限制，利用樹脂進行純化的方法普遍認為是不安全的，因此不適宜作為提取無異味蘿卜紅色素的方法。而其他諸如水蒸氣蒸餾法[8]、酶解法[5]、膜分離法[9]、超臨界CO2萃取[10]等方法，則面臨著生產(chǎn)危險系數(shù)較高、能耗較大、成本高、膜回收利用困難等問題，不適于進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋求一種異味脫除效果好，又能用于工業(yè)化生產(chǎn)的高品質(zhì)蘿卜紅色素提取工藝顯得至關(guān)重要。

研究針對這些問題入手，采用多種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法，并在保證蘿卜紅色素提取率的前提下，嘗試多種提取方法的結(jié)合，從而在色素提取過程中減少或消除蘿卜紅色素中的異味成分，以期達到較好的除味效果，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的無異味蘿卜紅色素。通過比較不同提取方法對蘿卜色素提取量和除臭程度的影響，確定出最優(yōu)的提取工藝，可為無異味蘿卜紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供思路，并進一步開發(fā)蘿卜紅色素的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

新鮮紅心蘿卜，市售。

1.1.2 主要試劑

檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、醋酸、正己烷、烯丙基異硫氰酸酯、嗎啉、丙酮、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸，以上試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；ST3100型pH計，奧豪斯儀器有限公司；JYL-CO12型榨汁機，山東九陽股份有限公司；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；SH8-III循環(huán)水式多用真空泵，西安常儀儀器設備有限公司；J-HH-6A型電熱恒溫水浴鍋，上海盛衛(wèi)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘿卜紅色素提取方法

1.2.1.1 鮮切蘿卜提取蘿卜紅色素

取新鮮紅心蘿卜，洗凈去皮，分割成厚度2～3 nm的蘿卜片，準確稱取25 g，進行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測。

1.2.1.2 熱燙處理提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL沸水中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進行榨汁處理，分別收集熱燙汁液、榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測。

1.2.1.3 酸性水溶液提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，進行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測。

1.2.1.4 兩相法提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，進行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入去離子水，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的去離子水1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測。

1.2.2 酸提法單因素試驗對提取蘿卜紅色素的影響

1.2.2.1 不同提取溫度的影響

提取方法見1.2.1.3，提取溫度分別設定為15，25，35，45，55和65 ℃。

1.2.2.2 不同提取時間的影響

提取方法見1.2.1.3，設定提取時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h。

1.2.2.3 不同料液比的影響

提取方法見1.2.1.3，將殘渣分別以料液比1∶3，1∶5，1∶7，1∶9和1∶11（g/mL）的比例加入1%檸檬酸水溶液。

1.2.2.4 不同提取pH的影響

提取方法見1.2.1.3，浸提pH分別調(diào)至2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5。

1.2.3 提取組合方式對蘿卜紅色素含量的影響

1.2.3.1 酸性水熱燙法提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL煮沸的1%檸檬酸水溶液中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進行榨汁處理，分別收集熱燙汁液、榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，定容至250 mL，保存待測。

1.2.3.2 酸性水兩相法提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，進行榨汁處理，分別收集榨汁液和殘渣。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的1%檸檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測。

1.2.3.3 酸性水熱燙兩相法提取蘿卜紅色素

準確稱取25 g蘿卜片，立即置于50 mL煮沸的1%檸檬酸水溶液中熱燙10 min，冷卻后，將蘿卜片進行榨汁處理，然后分別把熱燙汁液、榨汁液和殘渣進行收集。將殘渣按照1∶5（g/mL）的料液比加入1%檸檬酸水溶液，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.5，在45 ℃條件下攪拌浸提2 h，使用抽濾裝置進行抽濾，收集浸提液，最后將熱燙汁液、榨汁液與浸提液混合，以之前所加入的1%檸檬酸水溶液1∶1的比例加入正己烷溶液，將混合物在45 ℃下攪拌并萃取1 h，倒入分液漏斗中并靜置30 min。取出下相液，定容至250 mL，保存待測。

1.2.4 蘿卜紅色素的含量測定

蘿卜紅色素含量測定方法參考Lee等[11]的pH示差法，使用兩種不同的緩存體系：0.25 mol/L氯化鉀緩沖溶液（pH 1.0）和0.45 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）。取1 mL色素提取液放入10 mL的具塞刻度試管中，再加入相應的緩存溶液稀釋定容后，分別在最大吸收波長處測定吸光度（此次試驗通過光譜掃描確定2種對應體系λman=510和700 nm處吸光度最大），蘿卜紅色素含量可按照式（1）計算：

式中：A為pH 1.0（A510-A700）-pH 4.5（A512-A700）；MW以天竺葵素-3-葡萄糖苷計算，相對分子質(zhì)量為433.2；DF為稀釋倍數(shù)，10；V為提取液最終體積，mL；1 000為單位換算比例，g換算為mg；ε為天竺葵素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)，31 600 cm-1mg-1；m為原料的質(zhì)量，g。

1.2.5 異硫氰酸酯的含量測定

異硫氰酸酯的含量采用嗎啉滴定法[12]測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

上述的每次試驗均設3個重復測定。測定所得數(shù)據(jù)制作成柱形圖以及折線圖進行分析，檢驗不同提取工藝的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝下蘿卜紅色素含量分析

一些新興的蘿卜紅色素提取方法，如超濾技術(shù)、酶工程技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、高速分離等，雖具有耗時少、純度和產(chǎn)量高等特點，但需要的技術(shù)和儀器成本過高，未能普遍應用，因此傳統(tǒng)提取方法仍占據(jù)工業(yè)生產(chǎn)重要地位[13]。常用于提取蘿卜紅色素的溶劑有水、乙醇、甲醇、異丙醇和冰醋酸等，考慮到成本，工業(yè)上一般采用水提法[14]。由圖1可知，熱燙法提取的蘿卜紅色素含量最低，主要是因為高溫條件下部分蘿卜紅色素分解損失。其次是鮮切法和兩相法，而兩相法僅在鮮切法的基礎上加上了正己烷萃取的步驟，這說明正己烷的加入對蘿卜紅色素的提取量影響較小，這與蘿卜紅色素在正己烷溶劑中溶解度較低相符[15]。但是有研究表明，正己烷對于蘿卜中硫代葡萄糖苷及其分解產(chǎn)生的一系列小分子含硫化合物均有較好的提取效果[16]。因此，作為食品工業(yè)中提取天然花青素著色劑較為安全且有潛力的有機溶劑，正己烷在蘿卜紅色素異味去除具有潛在的應用優(yōu)勢[17]。另外，酸提法提取的蘿卜紅色素含量最多，這主要是因為酸堿度能夠顯著影響蘿卜紅色素的顏色及穩(wěn)定性，而色素在酸性條件下較穩(wěn)定，在中性或堿性條件下易分解[4]。也有研究表明酸性條件可以加快細胞壁的破裂，從而增大色素提取率[7]?？傮w而言，從蘿卜紅色素提取效果而言應選提取效率高、省時、省錢和安全的酸提法。

圖1 不同提取工藝對蘿卜紅色素提取含量的影響

2.2 酸提法單因素對提取蘿卜紅色素含量的影響

2.2.1 不同提取溫度下蘿卜紅色素的含量

由圖2可知，酸提法提取的蘿卜紅色素隨著提取溫度的升高，提取量增加，在45 ℃時提取量為1.48 mg/g，到達最高值，45 ℃后隨著溫度的升高而逐漸下降。這是因蘿卜紅色素屬于天然花色苷類色素，在酸性條件下提取溫度過高會使花色烊陽離子降低，且升溫可促進傳質(zhì)，有利于提高蘿卜紅色素的提取，但高溫會導致紅色素的分解，同時也會導致提取量的減少[18-19]。因此選擇提取溫度45 ℃最佳。

圖2 提取溫度對蘿卜紅色素提取量的影響

2.2.2 不同提取時間蘿卜紅色素的含量

由圖3可以看出，提取時間在0.5～2 h之間，蘿卜紅色素提取量隨提取時間的增長而逐漸增大，但2 h后繼續(xù)增加提取時間提取量變化不大，結(jié)果表明，在2 h之后增加提取時間對蘿卜紅色素的提取量沒有明顯變化，因而提取時間2 h最為適合。

2.2.3 不同的提取料液比蘿卜紅色素含量

就單提取率而言，提取料液比越大，越有利于提取色素，但料液配比過大，提取液中的色素含量太低，將增加生產(chǎn)成本，因此在工業(yè)性生產(chǎn)中需權(quán)衡利弊[20]。由圖4可知，提取料液比在1∶5（g/mL）時蘿卜紅色素的提取量達到最大值（1.46 mg/g），在1∶5（g/mL）后隨著料液比增加，蘿卜紅色素的提取量呈緩慢增加趨勢，這說明在殘渣與料液比例為1∶5（g/mL）后再增加料液比對蘿卜紅色素提取量影響不大，因此，結(jié)合經(jīng)濟成本考慮，選擇1∶5（g/mL）提取料液比最佳。

圖3 提取時間對蘿卜紅色素提取量的影響

圖4 提取料液比對蘿卜紅色素提取量的影響

2.2.4 提取pH的確定

在酸性環(huán)境中，花青素基本以紅色的黃鋅鹽形態(tài)存在，而在堿性環(huán)境中，基本以藍色的醒式形態(tài)存在，當處于等電點時，顏色變到最淺，花青素結(jié)構(gòu)介于黃鋅鹽形式和醒式形式結(jié)構(gòu)之間[21]。從圖5可以看出，蘿卜紅色素的提取量隨著提取的pH增加而逐漸降低，強酸條件可以促進植物細胞壁的分解，且蘿卜紅分子結(jié)構(gòu)在低pH下向醌式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而醌式結(jié)構(gòu)在水中的溶解度最大，從而使色素的提取率增加[7]。當溶液pH為2.5時，提取的蘿卜紅色素含量達最大值，因此，選擇提取pH 2.5最佳。

圖5 pH對蘿卜紅色素提取量的影響

2.3 提取組合方法對蘿卜紅色素含量的影響

將圖6與圖1對比分析可以發(fā)現(xiàn)，酸性水熱燙法的提取效果要顯著高于熱燙法，說明蘿卜在熱燙基礎上，相對于去離子水提取，檸檬酸水溶液提取具有較好的提取效果；但是酸性水熱燙法的提取效果略低于酸提法，這說明該組合提取方式因蘿卜高溫熱燙導致部分色素分解損失。另外，酸性水兩相法提取效果要高于兩相法則再次說明酸性條件色素提取效果較好；酸性水兩相法提取效果與酸提法基本一致，而酸性水兩相法僅在酸提法的基礎上加上了正己烷萃取的步驟，說明針對色素提取效果而言，正己烷的加入對蘿卜紅色素提取影響不大，這與前述結(jié)果一致。同理，酸性水熱燙兩相法的提取效果要低于酸提法也是因為高溫熱燙色素的損失導致。從圖6可知，3種組合方法中酸性水兩相法的提取效率最高，也是基于另外兩種方法中高溫對色素的破壞所致。因此，針對所有提取方法進行分析，從蘿卜紅色素的提取效果而言，酸提法和酸性兩相法具有最好的提取效果。

圖6 提取組合方法對蘿卜紅色素含量的影響

2.4 提取方式對異硫氰酸酯含量的影響

2.4.1 不同提取工藝對異硫氰酸酯含量的影響

由圖7可知，鮮切法提取得到的蘿卜紅色素中異硫氰酸酯含量最高，因為鮮切紅心蘿卜時細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細胞不同部位含有的蘿卜硫苷及黑芥子酶相互接觸，使硫苷分解產(chǎn)生異味成分異硫氰酸酯，因此其含量最高。相對于鮮切法，酸提法中異硫氰酸酯含量有所降低，低pH下的異硫氰酸酯含量較低可能是由于低pH下黑芥子酶活性受到抑制，蘿卜硫苷水解速率降低，而在pH接近中性的去離子水中，硫苷可以較快進行酶降解產(chǎn)生異硫氰酸酯[22]。另外，熱燙法提取得到的蘿卜紅色素中異硫氰酸酯含量最低，說明熱燙處理可以滅活黑芥子酶，從而減少蘿卜中硫苷的酶解，降低異硫氰酸酯的生成，達到大幅度減小色素提取液的臭味的目的。由于常規(guī)高溫處理往往加熱不均勻，導致滅酶活不充分，基于微波在高水分物質(zhì)里具有良好穿透性和快速加熱性的特點，因此也有研究采用高功率微波爐加熱法，使得滅活過程快速而徹底[7]。從圖7還可以看出，兩相法得到的異硫氰酸酯含量與熱燙法差異較小，說明正己烷的加入可以溶解異硫氰酸酯等異味成分，從而降低蘿卜紅色素中的異味，這與Chen等[23]研究結(jié)果一致。蘿卜紅色素本身不溶于正己烷溶劑，因此其在兩相中分配在下相水中，而已經(jīng)酶解產(chǎn)生的異味成分則進入上相正己烷中，進而將蘿卜紅色素與異硫氰酸酯等異味成分分開，達到除味的效果。

2.4.2 提取組合方式對異硫氰酸酯含量的影響

熱燙法、酸提法、兩相法相對于鮮切法均具有較好的除味效果，因此這3種提取方法進行綜合研究，旨在保證蘿卜紅色素較好提取率的同時，降低蘿卜紅色素中的異味成分，以優(yōu)化提取工藝。從圖8可以看出，酸性水熱燙法、酸性水兩相法和酸性水熱燙兩相法相比于單一提取方法，其異硫氰酸酯含量均有不同程度降低，其中酸性水熱燙兩相法含量最低，說明3種方法同時組合對于異味的去除效果較好。前期的熱燙處理使黑芥子酶失活，甚至為減少蘿卜紅色素熱降解損失而降低熱燙時間導致酶滅火不足，因為下相檸檬酸溶液的酸性，還能使蘿卜硫苷的酶解過程受到抑制[24]，而殘留的異硫氰酸酯等異味成分則進入到正己烷層中，因此其除異味的效果最好。

圖7 不同提取工藝對異硫氰酸酯含量的影響

圖8 提取組合方式對異硫氰酸酯含量的影響

3 結(jié)論

研究表明，蘿卜紅色素提取工藝受提取的溫度、時間、pH、試劑和料液比等因素的影響，單一提取方法無法同時滿足蘿卜紅色素的提取效率及除異味的效果。針對單一提取方法的不足，通過提取方法的組合以期達到較好的效果。就蘿卜紅色素提取效果而言，酸提法和酸性水兩相法具有最佳的提取效果；就除異味效果而言，提取方式的組合相對于單一提取方法均具有較好的除異味效果，其中酸性水熱燙兩相法得到的色素中異硫氰酸酯含量最低，說明其除味效果最好。綜合分析不同提取工藝下蘿卜紅色素的提取效率及除異味效果，酸性水熱燙兩相法雖然因為熱燙處理導致蘿卜紅色素含量有所降低，但具有最佳的除味效果，能夠顯著提升蘿卜紅色素的經(jīng)濟價值，因此擇其為去異味蘿卜紅色素的最佳提取方法。提取條件：選用1%檸檬酸水溶液為提取試劑，熱燙10 min，提取溫度為45 ℃，提取時間為2 h，提取的料液比為1∶5（g/mL），提取pH為2.5，正己烷于45 ℃兩相攪拌萃取1 h。該方法具有操作簡單，耗時短，成本低，除味效果好，產(chǎn)量高，安全無毒，適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。