LM609聯(lián)合TBBPA對(duì)斑馬魚神經(jīng)行為毒性的影響

李佳妮，陳將飛，董昊嘉，王紅珠，史清玉，喻家健，黃長(zhǎng)江

(溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325000)

四溴雙酚A(TBBPA)是一種廣泛使用的溴代阻燃劑[1]，常被應(yīng)用于各種塑料制品，在日常生活中常有添加，如母嬰制品、工業(yè)制品等，在環(huán)境中有較高劑量的存在[2]。有研究表明，TBBPA在使用及降解過程中對(duì)水源、空氣等環(huán)境造成污染，從而間接進(jìn)入人體，極微小的劑量就可引起毒性反應(yīng)，引起生物體的神經(jīng)毒性，且毒性效應(yīng)會(huì)根據(jù)發(fā)育時(shí)期的不同而改變，但其毒性機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，TBBPA是甲狀腺激素(T4，四碘甲狀腺原氨酸)的結(jié)構(gòu)類似物[3]。T4是一種氨基酸衍生物，在生物體遭受刺激時(shí)，下丘腦釋放促甲狀腺激素釋放激素(TRH)刺激垂體，垂體前葉收到刺激產(chǎn)生促甲狀腺激素(TSH)，TSH進(jìn)一步刺激甲狀腺釋放T4，T4通過αVβ3信號(hào)通路發(fā)揮作用[4]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)TBBPA進(jìn)入生物體后，會(huì)與T4受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，影響αVβ3信號(hào)通路，使得該信號(hào)通路紊亂，影響機(jī)體正常的生命活動(dòng)。在動(dòng)物體內(nèi)，Anti-Integrin αVβ3 抗體(LM609)是一種能阻斷αVβ3整合素與纖維黏連素結(jié)合的抗體[5]，能夠在一定程度上阻斷αVβ3信號(hào)通路，因此，我們猜想LM609的添加可在一定程度調(diào)節(jié)因TBBPA導(dǎo)致的αVβ3信號(hào)通路的紊亂，挽救TBBPA的神經(jīng)毒性。

斑馬魚是一種新型的模式生物，相比于嚙齒動(dòng)物而言，斑馬魚具有體型小、易繁殖的特點(diǎn)。斑馬魚的胚胎在體外發(fā)育，易觀察易操作，可實(shí)時(shí)記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)過程，適合進(jìn)行多種體外實(shí)驗(yàn)，且目前斑馬魚的實(shí)驗(yàn)技術(shù)均已成熟，如斑馬魚胚胎行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、斑馬魚胚胎顯微注射[6]、斑馬魚基因突變體構(gòu)建[7]等。因此，斑馬魚在毒理學(xué)研究、神經(jīng)行為學(xué)研究等方面均有卓越的優(yōu)勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)行了斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、接觸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、光暗周期實(shí)驗(yàn)，以比較LM609添加前后TBBPA的毒性效應(yīng)，從而評(píng)價(jià)LM609與TBBPA聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)毒性影響，進(jìn)而明確TBBPA進(jìn)入生物體產(chǎn)生毒性的機(jī)制是否與αVβ3信號(hào)通路有關(guān)[8]。通過本研究，可以為溴代阻燃劑的合理使用提供指導(dǎo)，也為溴代阻燃劑造成的臨床疾病治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚為來自美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)斑馬魚實(shí)驗(yàn)室的野生型AB品系斑馬魚，飼養(yǎng)于全封閉式水循環(huán)系統(tǒng)，光暗周期設(shè)置為14 h光照、10 h黑暗，喂食孵化完全的豐年蟲，每日2次，每次間隔12 h左右，20 d齡以下的幼魚喂食專用的幼魚飼料[9]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本研究所用試劑主要有純度為100%的Anti-Integrin αVβ3 抗體(LM609)(Ab190147，Abcam)，純度≥99%的TBBPA(分子量為543.87 u，79-94-7，Aldrich)，分析純的二甲基亞砜(DMSO)(分子量為78.12 u，67-68-5，上海展云化工有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全封閉式斑馬魚循環(huán)系統(tǒng)Aquatic Habitats Stand-Alone System(美國(guó)AHAB公司)；斑馬魚光照恒溫胚胎培養(yǎng)箱(RXZ-300C，寧波江南儀器廠)；體式顯微鏡(Nikon SMZ1500，上海千欣儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑的配制

實(shí)驗(yàn)藥品的配制：使用1×PBS緩沖液將LM609稀釋至50 μg·mL-1工作液，以酚紅為指示劑用于顯微注射；TBBPA先用DMSO配制2 mmol母液，使用時(shí)將其稀釋1 000倍即為2 μmol工作液；對(duì)照組使用千分之一濃度的DMSO處理。

胚胎培養(yǎng)液(EM)的配制：稱取0.8 g NaCl，0.04 g KCl，0.003 58 g Na2HPO4，0.006 g KH2PO4，0.144 g CaCl2，0.246 g MgSO4·7H2O，0.35 g NaHCO3，800 mL超純水置于1 L燒杯中，超聲攪拌至澄清，再用超純水定容至1 L，滴加1 mol NaOH溶液調(diào)pH至7.2即可。

1.3 斑馬魚胚胎的收集及前期處理

提前2～3 d對(duì)斑馬魚雌雄分缸喂養(yǎng)并加餐，在收集斑馬魚胚胎的前一晚，按照雌魚∶雄魚1∶1的比例將斑馬魚分別放置于孵化框中，避光放置并插好擋板，第二日早上10點(diǎn)將擋板拔掉，并將孵化框置于陽光處，雄魚將追尾雌魚進(jìn)行交配，約20 min后交配結(jié)束，收集胚胎。將胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗3遍后，挑出狀態(tài)不好的胚胎，其余胚胎置于胚胎培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日檢查胚胎狀態(tài)，及時(shí)將死亡胚胎挑出，并更換新的培養(yǎng)液。

1.4 斑馬魚胚胎顯微注射LM609

在收集并清洗斑馬魚胚胎后，在顯微鏡下及時(shí)挑選出健康的胚胎，1 h內(nèi)的胚胎為單細(xì)胞期，挑選單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎，將其逐個(gè)排列在顯微注射板上，用于顯微注射。顯微注射使用6 μL體系，即酚紅指示劑1 μL與5 μL的LM609工作液，混勻后將其注射至斑馬魚胚胎的卵黃囊中，在顯微鏡下可明顯觀察到斑馬魚胚胎卵黃囊部分有淡紅色暈塊即為注射成功。10 min后在顯微鏡下觀察，挑出狀態(tài)不好及死去的斑馬魚胚胎，剩余斑馬魚胚胎置于添加1‰雙抗的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.5 斑馬魚胚胎暴毒及神經(jīng)行為實(shí)驗(yàn)

1.5.1 斑馬魚胚胎暴毒

設(shè)置對(duì)照組、2 μmol TBBPA暴露組、50 μg·mL-1LM609暴露組、TBBPA聯(lián)合LM609暴露組共4組，前2組使用野生型斑馬魚胚胎進(jìn)行暴毒，后2組使用注射LM609的斑馬魚胚胎進(jìn)行暴毒，暴毒窗口設(shè)置為8～48 hpf(hours post fertilization，受精后小時(shí)數(shù))。在斑馬魚胚胎半胞期即8 hpf時(shí)進(jìn)行暴毒，將發(fā)育健康的野生型斑馬魚胚胎和顯微注射LM609的斑馬魚胚胎分別置于6孔板中，每孔30枚胚胎，每組設(shè)置3個(gè)孔即為3個(gè)重復(fù)，每孔5 mL暴毒液，對(duì)照組則用1‰ DMSO作為對(duì)照，蓋好保鮮膜避免暴毒液的揮發(fā)，將其置于胚胎培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

胚胎于48 hpf時(shí)脫毒，將暴毒液吸出后用EM清洗3次，每孔加入5 mL EM后蓋上新的保鮮膜，置于胚胎培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。斑馬魚胚胎約在72 hpf時(shí)全部脫膜，及時(shí)將脫掉的胚胎膜挑出，待5 dpf(Days post fertilization，受精后天數(shù))后將發(fā)育良好的斑馬魚仔魚轉(zhuǎn)移至容量為2 L的幼魚缸中飼養(yǎng)，每天喂食3次適量小魚飼料，及時(shí)觀察斑馬魚幼魚的發(fā)育狀態(tài)，并將死掉的仔魚挑出。

1.5.2 斑馬魚行為實(shí)驗(yàn)

在18～24 hpf時(shí)，每2 h記錄各暴毒組斑馬魚胚胎的擺尾次數(shù)作為自主運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)，每組記錄60條魚。

在48 hpf時(shí)，先將各組斑馬魚胚胎脫毒后，用鏈霉蛋白酶脫膜后，用針灸針輕輕觸碰斑馬魚仔魚的尾部，記錄其受到觸碰后的運(yùn)動(dòng)距離，作為斑馬魚的觸摸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

斑馬魚光暗周期實(shí)驗(yàn)挑選各組健康的、發(fā)育良好的、無肉眼可見畸形的斑馬魚仔魚進(jìn)行，行為實(shí)驗(yàn)使用ViewPoint Zebra-Lab行為儀[10]。斑馬魚幼魚5 dpf的運(yùn)動(dòng)速度實(shí)驗(yàn)用24孔板，在屏幕上繪制出24個(gè)與孔板重合的大小形狀相同的圓形，24孔板每孔加入1.5 mL的超純水。每組挑選24條發(fā)育健康的活躍幼魚，用巴氏滴管轉(zhuǎn)移到上述的備好的24孔板中，每孔1條幼魚。將每個(gè)暴毒組都依次準(zhǔn)備好并記錄，于光照恒定、溫度恒定(28 ℃)的安靜環(huán)境中適應(yīng)20～30 min，于120 hpf(上午10點(diǎn))開始實(shí)驗(yàn)。

Tracking模式參數(shù)為：背景像素20 pixels；速度1.5～3.0 mm·s-1；每隔60 s數(shù)據(jù)輸出；程序光周期強(qiáng)度或持續(xù)光照強(qiáng)度為100%(500 1x)。每個(gè)程序設(shè)置為5 min光照、5 min黑暗、5 min光照、5 min黑暗、5 min光照，共計(jì)25 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。數(shù)據(jù)描述方法若無特殊說明，使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)先進(jìn)行Shapira-Wikinson正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊則進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布或方差不齊，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Welch法近似t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；當(dāng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水平為P<0.05時(shí)，認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM609聯(lián)合TBBPA暴露對(duì)斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)的影響

LM609聯(lián)合TBBPA暴露至18～26 hpf時(shí)，對(duì)各組的斑馬魚胚胎進(jìn)行了自主運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)(圖1)。18 hpf時(shí)，各組斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)趨近于0，與對(duì)照組相比，僅2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)上調(diào)且有顯著性差異；2 μmol TBBPA暴毒組與50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)無顯著性差異。20 hpf時(shí)，較18 hpf斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)增多(圖1中A)；2 μmol TBBPA暴毒組與對(duì)照組相比，自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著性上調(diào)；LM609暴露組斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)與對(duì)照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1中C)。22 hpf時(shí)，較20 hpf斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)增多(圖1中A)；2 μmol TBBPA暴毒組與對(duì)照組相比，斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著上調(diào)；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1中D)。24 hpf時(shí)，斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)最多(圖1中A)；與對(duì)照組相比，2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯上調(diào)且有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)增多，但與對(duì)照組相比均無顯著性差異(圖1中E)。26 hpf時(shí)，斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)開始下調(diào)(圖1中A)；與對(duì)照組相比，2 μmol TBBPA暴毒組自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯上調(diào)且有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)稍多，但均無顯著性差異(圖1中F)。各暴毒組斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)呈拋物線式，在24 hpf時(shí)各組斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)均達(dá)到最高值，之后開始下調(diào)?？傮w而言，2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯上調(diào)且有顯著性差異。自主運(yùn)動(dòng)的結(jié)果表明，聯(lián)合暴露組挽救了因TBBPA所造成的斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)的增多，LM609對(duì)TBBPA的自主運(yùn)動(dòng)毒性效應(yīng)具有挽救效應(yīng)。

2.2 LM609聯(lián)合TBBPA暴露對(duì)斑馬魚接觸反應(yīng)的影響

50 μg·mL-1LM609聯(lián)合TBBPA暴露至48 hpf時(shí)，對(duì)各暴毒組的斑馬魚胚胎脫膜后進(jìn)行了接觸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每組檢測(cè)24條魚。對(duì)照組斑馬魚仔魚的接觸反應(yīng)距離達(dá)到(22.07±2.458)mm；2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚仔魚的接觸反應(yīng)距離降低至(13.46±0.688)mm，與對(duì)照組相比具有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚仔魚的接觸反應(yīng)距離上調(diào)，達(dá)到(22.27±2.391)mm，但是與對(duì)照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚仔魚的觸摸反應(yīng)距離上調(diào)為(25.74±2.541)mm，與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖2)。結(jié)果表明，2 μmol TBBPA暴露導(dǎo)致斑馬魚仔魚的觸摸反應(yīng)距離顯著下調(diào)，2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒則使得斑馬魚仔魚的觸摸反應(yīng)距離上調(diào)，LM609對(duì)TBBPA所導(dǎo)致的接觸反應(yīng)毒性作用具有挽救效應(yīng)。

2.3 LM609聯(lián)合TBBPA暴露對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)速度的影響

50 μg·mL-1LM609聯(lián)合TBBPA暴露至48 hpf脫毒后，于EM中培養(yǎng)至5 dpf時(shí)，對(duì)各暴毒組的健康的斑馬魚仔魚進(jìn)行了光暗周期的實(shí)驗(yàn)，每組檢測(cè)24條魚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在光照情況下，對(duì)照組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.576±0.043 25)mm·s-1；2 μmol TBBPA暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.164±0.033 57)mm·s-1，與對(duì)照組相比顯著下調(diào)；50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.693±0.035 52)mm·s-1，與對(duì)照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.490±0.041 47)mm·s-1，與50 μg·mL-1LM609單獨(dú)暴毒組相比顯著下調(diào)，與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖3中A)。在黑暗情況下，各暴毒組斑馬魚仔魚的自由游泳速度均較光照情況上調(diào)，對(duì)照組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.938±0.033 96)mm·s-1，2 μmol TBBPA暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.736±0.032 02)mm·s-1，與對(duì)照組相比顯著性下調(diào)；50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.737±0.045 56)mm·s-1，與對(duì)照組相比顯著性下調(diào)；2 μmol TBBPA聯(lián)合50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.851±0.032 04)mm·s-1，與對(duì)照組相比無明顯差異，與50 μg·mL-1LM609單獨(dú)暴毒組相比上調(diào)(圖3中B)。所有的暴毒組在黑暗條件下的自由游泳速度均高于光照條件下的自由游泳速度，趨勢(shì)保持穩(wěn)定。光暗周期實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合暴露能夠挽救TBBPA導(dǎo)致的斑馬魚光暗情況下自由游泳速度的下調(diào)，且在光照條件下挽救上調(diào)作用更加明顯。

18～26 hpf斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)，檢測(cè)指標(biāo)為斑馬魚胚胎在各個(gè)時(shí)間發(fā)育節(jié)點(diǎn)的擺尾次數(shù)；A—各組斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)圖；B～F—各組斑馬魚胚胎在不同的時(shí)間發(fā)育節(jié)點(diǎn)擺尾次數(shù)；*—代表不同處理間有顯著性差異，不同處理間標(biāo)有不同字母代表處理間有顯著性差異，P<0.05。圖2～3同。圖1 聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)的影響

圖2 48 hpf時(shí)斑馬魚仔魚接觸反應(yīng)

A—斑馬魚僅在光照情況下的自由游泳速度；B—斑馬魚僅在黑暗情況下的自由游泳速度。圖3 5 dpf時(shí)斑馬魚仔魚自由游泳速度

3 討論

目前對(duì)于單獨(dú)化合物[11]的毒理學(xué)效應(yīng)研究較多，但是對(duì)于其機(jī)制研究的較少，化合物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)是以何種途徑轉(zhuǎn)化繼而發(fā)揮毒性效應(yīng)的，這才是化合物暴露的研究重點(diǎn)。近年來，隨著斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)的不斷成熟，使得一些不易體外暴露產(chǎn)生效應(yīng)的物質(zhì)，如抗體、激素等，很容易就能注射到斑馬魚胚胎的卵黃囊內(nèi)，繼而發(fā)揮效應(yīng)。使得我們?cè)谘芯炕衔锉┞兜臋C(jī)體效應(yīng)時(shí)，能夠?qū)⒁恍┡c化合物機(jī)體效應(yīng)途徑相關(guān)的激素或者抗體等注射進(jìn)入斑馬魚胚胎內(nèi)，使其聯(lián)合暴毒，可能會(huì)對(duì)化合物在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化效應(yīng)產(chǎn)生干擾，以明確化合物的致毒機(jī)制[12]，以便后續(xù)為該化合物的治療提供思路和參考。

斑馬魚的自主運(yùn)動(dòng)主要是斑馬魚尾部的擺動(dòng)[13]，與斑馬魚的次級(jí)神經(jīng)元無關(guān)，是受到斑馬魚初級(jí)神經(jīng)元支配的運(yùn)動(dòng)[14]，不依賴斑馬魚的腦部神經(jīng)元，是可檢測(cè)的最早的神經(jīng)行為[15]。觸摸反應(yīng)也是如此。斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)一般在19 hpf時(shí)開始，TBBPA暴毒導(dǎo)致胚胎自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯增多，接觸反應(yīng)運(yùn)動(dòng)距離減少；LM609與TBBPA的聯(lián)合暴露則使得斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)和觸摸反應(yīng)恢復(fù)到正常值，LM609對(duì)TBBPA的神經(jīng)毒性效應(yīng)具有挽救作用。

斑馬魚5 dpf的光暗周期實(shí)驗(yàn)可以很準(zhǔn)確的反應(yīng)斑馬魚在光暗情況下的速度，是衡量斑馬魚肌肉及神經(jīng)發(fā)育的一個(gè)很好的參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，TBBPA暴露導(dǎo)致斑馬魚在光暗情況下的速度均降低，經(jīng)LM609與TBBPA聯(lián)合暴露后，斑馬魚的運(yùn)動(dòng)速度又恢復(fù)至正常值，挽救效應(yīng)明顯。

LM609作為一種能夠阻斷T4作用途徑的抗體[16]，會(huì)使得機(jī)體內(nèi)的甲狀腺激素含量降低；TBBPA作為T4的結(jié)構(gòu)類似物，進(jìn)入機(jī)體后則會(huì)與T4受體結(jié)合[17]，可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)T4的含量上升。而本研究表明，就斑馬魚的神經(jīng)行為而言，LM609能夠挽救因TBBPA所導(dǎo)致的毒性效應(yīng)，則在一定程度上驗(yàn)證了TBBPA進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后，是通過升高機(jī)體內(nèi)的甲狀腺激素含量發(fā)揮作用的。這就為后續(xù)治療TBBPA所導(dǎo)致的神經(jīng)行為毒性提供了理論支撐，同時(shí)，LM609顯微注射的斑馬魚可作為一種T4研究的模式生物，也為甲狀腺相關(guān)的研究和治療提供了臨床依據(jù)。