苜蓿多葉品系BC2群體農(nóng)藝性狀改良效果研究

吳嘉龍， 魏臻武， Omer Idris Olom

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/揚(yáng)州大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

苜蓿(MedicagosativaL.)常見(jiàn)葉片形態(tài)為三出羽狀復(fù)葉，當(dāng)其葉柄上著生小葉數(shù)在3片以上時(shí)，則稱(chēng)之為多葉苜蓿。多葉苜蓿具有葉量大、蛋白含量高、消化率高、品質(zhì)好等特點(diǎn)，是提高飼料蛋白的優(yōu)良品種類(lèi)型，雖然多葉苜蓿具有良好的品質(zhì)性狀，但其生長(zhǎng)性能會(huì)有所降低，多葉苜蓿群體內(nèi)不同株系的生產(chǎn)性能不盡相同，因此通過(guò)培育多葉苜蓿群體選育優(yōu)良單株，培育高產(chǎn)型多葉苜蓿具有十分重要的意義[1-3]。苜蓿的多葉性狀從發(fā)現(xiàn)至今已有80年歷史，早在20世紀(jì)40年代，Mokeyeva[4]報(bào)道了苜蓿在春秋季有多葉型葉片的出現(xiàn)，而后Hart[5]、Bingham[6]、Etzel[7]等對(duì)苜蓿的多葉性狀進(jìn)行了更深入的研究。我國(guó)多葉苜蓿的選育工作最早由崔璐[8]、于林清[9]等展開(kāi)，研究表明多葉苜蓿材料存在遺傳不穩(wěn)定、多葉率差異較大的問(wèn)題，因此培育能夠穩(wěn)定遺傳、綜合性狀優(yōu)良的多葉型苜蓿新品種具有重要意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)苜蓿的多葉性狀進(jìn)行了研究，也有不少通過(guò)雜交、自交等方式構(gòu)建了多葉苜蓿群體。朱平華[10]構(gòu)建了多葉型與三葉型苜蓿雜交F1代，并對(duì)其遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)F1代可劃分為5個(gè)類(lèi)群，植株差異較大。唐嘉等[11]通過(guò)自交構(gòu)建多葉苜蓿S2群體，發(fā)現(xiàn)群體中性狀表現(xiàn)差異較大，生長(zhǎng)速率變緩且株高差異變大。

回交是將兩個(gè)親本雜交后，將雜交后代與親本之一進(jìn)行雜交的一種育種方法，在玉米、小麥等作物上已有較多運(yùn)用[12-14]。回交通常以綜合性狀優(yōu)良的品種作為輪回親本，而具有目標(biāo)性狀的品種作為非輪回親本，后代雜種中可獲得兼具親本優(yōu)良基因的優(yōu)良品種[15]。目前，我國(guó)國(guó)產(chǎn)苜蓿與國(guó)外仍有一定差距[16]，已育成多葉苜蓿品種少有報(bào)道，通過(guò)回交的方法構(gòu)建苜蓿群體，對(duì)紫花苜蓿新品種選育及綜合苜蓿高產(chǎn)與高質(zhì)量的相關(guān)性狀具有重要的研究意義。本研究將南澳品系多葉苜?！甈L34HQ’作為非輪回親本，‘淮陰苜?！癁檩喕赜H本構(gòu)建BC2(回交二代)群體，通過(guò)對(duì)200株BC2群體材料的農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性、主成分及聚類(lèi)分析，旨在探究回交群體各性狀的田間表現(xiàn)，研究多葉苜蓿回交群體的多代回交育種策略在群體改良以及單株選育的效果，以期選育出多葉表現(xiàn)穩(wěn)定且性狀優(yōu)良的苜蓿新品種，對(duì)高產(chǎn)、高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿的品種選育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以多葉苜?！甈L34HQ’為非輪回親本，3葉苜?！搓庈俎！癁檩喕赜H本的回交BC2群體為研究材料。非輪回親本為南澳品系，多葉性狀穩(wěn)定，多葉率高達(dá)86%，株型斜生，分枝數(shù)較少。輪回親本是我國(guó)江淮地區(qū)的苜蓿類(lèi)型，莖直立，株高高、分枝數(shù)多，綜合性狀好。

1.2 群體種植

田間試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)揚(yáng)子津校區(qū)牧草試驗(yàn)地(東經(jīng)119°36′，北緯32°43′)采用筒植技術(shù)種植，于2016,2017,2018年分別獲得F1，BC1，BC2群體，同年10月在田間PVC桶中種植，桶直徑16.5 cm，間距1.2 m，覆土深度一致。全生長(zhǎng)階段不施肥、不灌溉，使群體自然生長(zhǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1測(cè)定指標(biāo) 株高、單株多葉率(苜蓿多葉單株中含多葉的枝條數(shù)占總枝條數(shù)的百分比)、主枝多葉率(苜蓿多葉單株主枝上多葉葉片數(shù)占主枝總?cè)~片數(shù)的百分比)參照魏臻武、楊艷婷[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。莖粗、節(jié)間數(shù)、莖葉比采用韓清芳[2]的方法進(jìn)行測(cè)定。分枝數(shù)采用于林清、王運(yùn)濤[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。參照Humphries[19]的方法測(cè)定主枝長(zhǎng)度和側(cè)枝長(zhǎng)度，主枝長(zhǎng)度/節(jié)間數(shù)即節(jié)間長(zhǎng)度。均選取苜蓿的5個(gè)主枝進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2數(shù)據(jù)分析 用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 24.0進(jìn)行相關(guān)性、主成分分析分析，采用R語(yǔ)言進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BC2田間指標(biāo)相關(guān)性分析

由相關(guān)性分析結(jié)果(表1)可知，苜蓿的株高、分枝數(shù)、多葉率、莖粗、節(jié)間數(shù)、側(cè)枝長(zhǎng)度等性狀之間存在不同程度的相關(guān)性。株高與側(cè)枝長(zhǎng)度顯著正相關(guān)(P<0.05)，與分枝數(shù)、莖葉比、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度節(jié)間數(shù)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，表明在回交群體的改良過(guò)程中，株高性狀的提高有利于改善與產(chǎn)量相關(guān)的性狀，獲得更高的生物學(xué)產(chǎn)量，但隨著株高的提升，苜蓿莖葉比也會(huì)隨之增加，株高與多葉率負(fù)相關(guān)但不顯著，表明兩者之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性，具有改良潛力。主枝與單株多葉率極顯著正相關(guān)(P<0.01)，表明苜蓿的多葉性狀在群體中能夠很好的表達(dá)。

莖葉比與節(jié)間數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與株高、節(jié)間長(zhǎng)度、莖粗等極顯著極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與主枝多葉率、側(cè)枝長(zhǎng)度顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明多葉性狀和苜蓿的二級(jí)分枝能改善苜蓿的莖葉比。

2.2 BC2主要性狀頻數(shù)分布

由圖1可知，經(jīng)2次回交后，群體中單株的分枝數(shù)、株高、株型、側(cè)枝長(zhǎng)度等性狀均偏向于輪回親本，特別是株高和側(cè)枝長(zhǎng)度，改良效果明顯。BC2群體多葉率為25.5%，其中主枝多葉率50%以下38株，占多葉株數(shù)的74.5%。經(jīng)2代回交后群體中主枝多葉率表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但仍有13株主枝多葉率在50%以上，占多葉單株的25.6%，其中多葉率極高，主枝多葉率70%～90%的5株，保留了多葉親本的高多葉率特性。

表1 苜?；亟欢后w9個(gè)農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of 9 agronomic traits of population in the second backcrossing generation of alfalfa

在BC2群體中，苜蓿直立型莖占群體的77.5%；表現(xiàn)出二級(jí)分枝性狀的苜蓿占群體的75%，優(yōu)于輪回親本的占8.5%；莖粗主要集中在1.8～3.6 cm，占群體的80.5%；莖葉比低于非輪回親本的占群體10%；株高較非輪回親本有了很大程度的提高，株高主要集中在60～80 cm，占群體65.5%，株高大于輪回親本的20株占群體10%，分枝數(shù)主要集中于9～17之間，占群體的71.5%，優(yōu)于輪回親本的占9.5%。

2.3 回交親本及BC2群體材料聚類(lèi)分析

對(duì)群體材料的9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。在歐式距離為30時(shí)將200份材料劃分為5類(lèi)(圖2)。

第Ⅰ類(lèi)包含單株13份，占BC2群體總數(shù)的6.5%。該類(lèi)群二級(jí)側(cè)枝發(fā)達(dá)，莖葉比低，但未有多葉表達(dá)，株高性狀仍需改善，具有高產(chǎn)的潛力。

第Ⅱ類(lèi)包含7份材料，占BC2群體總數(shù)的3.5%。該類(lèi)群中包含兩株多葉單株，多葉表現(xiàn)在50%以下，株高、分枝數(shù)等性狀均低于其他4類(lèi)

第Ⅲ類(lèi)包含58份材料，占總數(shù)的29%。該類(lèi)群包含多葉材料28份，且平均多葉率在5個(gè)類(lèi)別中最高，綜合性狀偏向非輪回親本。

第Ⅳ類(lèi)包含20份材料，占群體10%。該類(lèi)別包含多葉單株3株，多葉率均在20%以下，平均株高74.95 cm，高于另外4個(gè)類(lèi)別，平均分枝數(shù)13.3個(gè)，二級(jí)分枝發(fā)達(dá)，苜蓿生長(zhǎng)過(guò)程中空間利用率高，綜合性狀偏向于非輪回親本，可用于選育高產(chǎn)苜蓿材料。

第Ⅴ類(lèi)包含單株102株，占群體51%。該類(lèi)別包含多葉單株21株，且具有多葉性狀表現(xiàn)良好的材料，平均株高72.23，分枝數(shù)14.45。該類(lèi)別綜合性狀偏向于非輪回親本，但有部分單株很好地保留了非輪回親本的優(yōu)良特性，綜合了雙親的優(yōu)良性狀，是選育多葉改良的優(yōu)秀苜蓿材料。

當(dāng)歐式距離為40時(shí)，Ⅳ類(lèi)和Ⅴ類(lèi)合并，占群體的61%。表明通過(guò)回交，大部分的后代材料會(huì)逐步趨向于輪回親本，經(jīng)過(guò)二次回交后，群體的性狀得到了一定程度的改良，但仍有必要進(jìn)行更多次的回交以改良群體性狀。

圖2 苜蓿親本及回交二代群體9個(gè)農(nóng)藝性狀聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis of 9 agronomic traits of parents and population of the second backcrossing of alfalfa注：1～200：BC2材料；201：非輪回親本‘PL34HQ’；202：輪回親本‘淮陰苜蓿’。*標(biāo)記單株為10株優(yōu)良單株Note:1～200:materials of the second backcrossing generation;201:nonrecurrent parent ’PL34HQ’;202:recurrent parent ‘Huaiyin’. * marked individual plants is 10 excellent individual plants

2.4 BC2群體主要農(nóng)藝性狀主成分分析

為揭示決定BC2農(nóng)藝性狀表現(xiàn)型變異的主要農(nóng)藝性狀，對(duì)9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了主成分分析。共有4個(gè)主成分因子入選，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了86.21%，表明這4個(gè)主成分因子代表了9個(gè)農(nóng)藝性狀在BC2代材料表現(xiàn)型變異的大部分信息。

主成分因子Y1反映了BC2后代材料性狀變異的30.83%，表達(dá)式為Y1=0.287X1+0.145X2+0.104X3+0.168X4+0.283X5—0.175X6—0.176X7+0.128X8+0.245X9。主成分因子Y1主要由X1(株高)、X5(莖粗)和X9(莖葉比)決定，因此可以認(rèn)為第一主成分代表了苜蓿的莖生長(zhǎng)能力。

主成分因子Y2反映了BC2后代材料性狀變異的22.37%，表達(dá)式為Y2=—0.070X1—0.087X2—0.386X3+0.401X4+0.039X5+0.146X6+0.169X7—0.184X8+0.299X9。主成分因子Y2主要由X3(節(jié)間數(shù))、X4(節(jié)間長(zhǎng)度)和X9(莖葉比)決定，第二主成分代表了苜蓿的節(jié)間性狀。

主成分因子Y3反映了BC2后代材料性狀變異的20.56%，表達(dá)式為Y3=0.247X1+0.233X2+0.247X3—0.053X4+0.100X5+0.422X6+0.409X7—0.073X8+0.021X9。主成分因子Y3主要由X6(主枝多葉率)、X7(單株多葉率)決定，第三主成分代表了苜蓿的多葉性狀。

主成分因子Y4反映了BC2后代材料性狀變異的12.46%，表達(dá)式為Y3=—0.142X1—0.407X2—0.092X3—0.022X4+0.420X5+0.188X6+0.195X7+0.662X8—0.092X9。主成分因子Y4主要由X8(側(cè)枝長(zhǎng)度)決定，第四主成分代表了苜蓿的二級(jí)分枝性狀。

2.5 高多葉表達(dá)的單株與親本農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

通過(guò)公式Z=(0.30827×Y1+ 0.22366×Y2+0.20560×Y3+0.12456×Y4)/0.86212。計(jì)算BC2群體各單株材料的綜合得分評(píng)價(jià)指標(biāo),并對(duì)后代材料的得分進(jìn)行排序(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選10株優(yōu)良單株均屬于第Ⅳ類(lèi)和第Ⅴ類(lèi)，且第Ⅴ類(lèi)占比高，表明第5類(lèi)類(lèi)群中單株存在雜種優(yōu)勢(shì)和超親優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)楦弋a(chǎn)、高質(zhì)的苜蓿新品系提供種質(zhì)資源，其中5號(hào)單株的Y3得分顯著高于其他單株，Y3代表苜蓿單株的多葉性狀，可作為多葉苜蓿回交的后續(xù)回交的親本。

表2 多葉苜?；亟蝗后w9個(gè)農(nóng)藝性狀的主成分分析Table 2 Principal components analysis among 9 agronomic traits of population of the second backcrossing generation of alfalfa

表3 苜蓿BC2群體優(yōu)良單株農(nóng)藝性狀綜合得分Table 3 Comprehensive score of agronomic traits of excellent plants in population of the second backcrokssing generation of alfalfa

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)苜蓿田間指標(biāo)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，株高與分枝數(shù)、莖粗、節(jié)間數(shù)、節(jié)間長(zhǎng)度極顯著正相關(guān)、與側(cè)枝長(zhǎng)度顯著正相關(guān)，這與前人結(jié)果一致[20-21]。苜蓿株高、分枝數(shù)、側(cè)枝長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)等性狀是影響產(chǎn)草量的重要性狀[22-23]，而隨著群體株高性狀的改善，分枝數(shù)、側(cè)枝長(zhǎng)度、節(jié)間數(shù)、莖粗等產(chǎn)量相關(guān)性狀會(huì)隨之提高，群體中這些產(chǎn)量相關(guān)性狀間的正相關(guān)性能夠有效的改善苜蓿的產(chǎn)草量，而苜蓿的莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度會(huì)隨著苜蓿株高的增加而增加，這兩個(gè)要素的提高可能是群體中苜蓿株高提升后莖葉比提高的原因。相比于主莖，苜蓿的二級(jí)分枝的直徑小于主莖莖粗，或許是提高苜蓿產(chǎn)量、降低苜蓿莖葉比的另一個(gè)優(yōu)良性狀。主枝多葉率與株高負(fù)相關(guān)但相關(guān)性不顯著，與楊艷婷[24]所得二者之間極顯著負(fù)相關(guān)有所不同，表明苜蓿多葉性狀受株高的影響經(jīng)二次回交后降低，更多株高較高的苜蓿單株中也開(kāi)始有多葉表現(xiàn)。主枝多葉率與單株多葉率極顯著正相關(guān)，這與楊艷婷的結(jié)果一致，表明苜蓿主枝多葉率高的同時(shí)苜蓿單株的單株多葉率也高，經(jīng)二次回交后回交群體中苜蓿多葉性狀仍然能夠得到很好的表達(dá)。

結(jié)合苜蓿株高的頻數(shù)分布情況以及聚類(lèi)分析分析結(jié)果，苜蓿BC2群體經(jīng)過(guò)回交改良后，群體株高較多葉親本得到了明顯改良，苜蓿群體中大部分單株的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀趨向于輪回親本，占群體的61%。群體的主枝多葉率、單株多葉率、群體多葉率等與多葉性狀相關(guān)的性狀減幅較大，而株高、側(cè)枝長(zhǎng)度、分枝數(shù)等與輪回親本有關(guān)的性狀得到了明顯的改良，這與滿(mǎn)強(qiáng)等人在小麥水旱地品種雜交獲得的結(jié)果相似[25]。于林清等[3]的研究結(jié)果表明多葉型苜蓿群體中后代多葉表達(dá)不穩(wěn)定的主要因素是雜交了許多非多葉型的苜?；ǚ?。而在本研究中，經(jīng)回交后苜蓿群體中的群體多葉率較低僅有25.5%且群體中主枝多葉率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，表明苜蓿的多葉性狀受基因的調(diào)控，隨著回交代數(shù)的增加，群體材料再次雜交了3葉輪回親本‘淮陰苜?！幕ǚ郏后w中輪回親本的基因比例增加從而使群體中多葉表達(dá)下降。本研究認(rèn)為苜蓿的多葉性狀由基因決定，柴小琴等[26]研究表明苜蓿的多葉性狀是由基因突變產(chǎn)生。但有多葉表達(dá)的苜蓿中多葉表現(xiàn)不盡相同，且有研究表明不同時(shí)期紫花苜蓿多葉表現(xiàn)具有較大差異[27]。苜蓿的多葉性狀由基因控制，其多葉表現(xiàn)的差異可能受其內(nèi)源激素、養(yǎng)分等因素變化的影響，具體影響因素仍有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)計(jì)算主成分得分?jǐn)?shù)值以及田間選育，群體中仍能選育出綜合得分高即綜合性狀優(yōu)良且保留高多葉特性的后代材料，表明通過(guò)株高品系‘淮陰苜?！投嗳~品系‘PL34HQ’的二代回交改良后，能夠獲得多葉率高且株高等性狀得到明顯改良的高產(chǎn)苜蓿材料。但隨著回交代數(shù)的增加，如果希望通過(guò)繼續(xù)回交獲得綜合性狀更優(yōu)良的多葉苜蓿品系，擴(kuò)大群體規(guī)模十分必要。本研究通過(guò)主成分得分的方式篩選回交群體中的優(yōu)良單株，所得結(jié)果與實(shí)際測(cè)得結(jié)果一致，表明該方法在苜?；亟缓蟠膯沃赀x育過(guò)程中具有應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)主成分值選種，在綜合得分最高的優(yōu)良株系中選育目標(biāo)性狀主成分值最高的株系，可使選育工作更具有目標(biāo)性，提高選育效率和效果。

4 結(jié)論

BC2群體材料在綜合性狀上偏向于輪回親本‘淮陰苜?！?，部分植株在保留非輪回親本高多葉特性的基礎(chǔ)上結(jié)合了‘淮陰苜?！膬?yōu)良性狀，表現(xiàn)優(yōu)于雙親。多葉性狀在回交群體中能很好的表達(dá)，株高、側(cè)枝長(zhǎng)度、節(jié)間數(shù)等性狀中存在超親效應(yīng)。BC2群體可分為5類(lèi)，綜合了輪回親本‘淮陰苜?！头禽喕赜H本‘PL34HQ’優(yōu)良性狀的第Ⅴ類(lèi)占群體的51%。主成分分析所得4個(gè)主成分因子對(duì)各農(nóng)藝性狀變異累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.21%，其中主成分因子Y3代表苜蓿的多葉性狀，貢獻(xiàn)率為20.56%。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)得分，篩選出了10個(gè)優(yōu)良株系，且5號(hào)單株代表多葉性狀的第3主成分得分極高，可作為重點(diǎn)選育對(duì)象。