HPLC-DAD同時(shí)測(cè)定風(fēng)熱感冒顆粒中6種活性成分的含量△

劉斌

泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 泰安 271000

風(fēng)熱感冒顆粒是由苦杏仁、板藍(lán)根、桑葉、連翹、菊花、牛蒡子等11味中藥提取制成的顆粒劑，具有清瘟解毒、宣肺利咽之功效，主要用于感冒身熱、鼻塞、頭痛、咳嗽、多痰等癥[1]。目前執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有顆粒劑的通則檢驗(yàn)，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目[1]，相關(guān)研究中也只有連翹苷和牛蒡苷的含量測(cè)定[2-4]。風(fēng)熱感冒顆粒中，苦杏仁中的苦杏仁苷具有止咳平喘的作用[5-6]；板藍(lán)根中的(R，S)-告依春具有抗病毒的作用[7-8]；桑葉中的蘆丁具有抗病毒、抑菌的作用[9-10]；連翹中的連翹酯苷A具有抗菌、抗炎的作用[11-12]；菊花中的3，5-O-二咖啡?；鼘幩峋哂幸志?、抗病毒的作用[13-14]；牛蒡子中的牛蒡苷具有抗炎、解熱的作用[15-16]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，針對(duì)上述6種成分在不同中成藥中的含量測(cè)定研究的報(bào)道較多[17-30]，但未見(jiàn)關(guān)于風(fēng)熱感冒顆粒中多種成分含量同時(shí)測(cè)定的方法研究。本研究首次以苦杏仁中的苦杏仁苷，板藍(lán)根中的(R，S)-告依春，桑葉中的蘆丁，連翹中的連翹酯苷A，菊花中的3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸，牛蒡子中的牛蒡苷為定量指標(biāo)，同時(shí)對(duì)風(fēng)熱感冒顆粒中的6種成分進(jìn)行含量測(cè)定。本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法(HPLC-DAD)，分別在207、245、330 nm波長(zhǎng)下，同時(shí)測(cè)定風(fēng)熱感冒顆粒中6種活性成分的含量，有利于快速、全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量，為風(fēng)熱感冒顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)；LC solution色譜工作站；XS205DU型十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品苦杏仁苷(批號(hào)：110820-201607，純度：90.7%)、(R，S)-告依春(批號(hào)：111753-201706，純度：100%)、蘆丁(批號(hào)：100080-200707，純度：90.5%)、連翹酯苷A(批號(hào)：111810-201707，純度：97.2%)、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?批號(hào)：111782-201706，純度：97.3%)、牛蒡苷(批號(hào)：110819-201309)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

風(fēng)熱感冒顆粒(山東孔府制藥有限公司，批號(hào)分別為20170404、20171002、20180414、180402；云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為ZAA1735、ZAA1736；吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰?，批?hào)分別為170606、180309；貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司，批號(hào)分別為20170613、20170810；吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為170606、180301；山西天成制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：318005；懷化正好制藥有限公司，批號(hào)分別為180412、180403；廣東恒誠(chéng)制藥有限公司，批號(hào)：1806201；規(guī)格均為10 g/袋)；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SymmetryShieldTMRP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，15%A；12～13 min，15%～10%A；13～26 min，10%～25%A；26～30 min，25%～35%A；30～40 min，35%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：苦杏仁苷、牛蒡苷為207 nm，(R，S)-告依春為245 nm，蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣?30 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL?？嘈尤受?、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍?種成分的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液和混合對(duì)照品溶液 稱(chēng)取苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍諏?duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.20、0.16、1.76、1.10、2.16、15.20 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇制成含苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷分別為460、8、88、55、108、760 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液 取本品研細(xì)，精密稱(chēng)取10 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率：300 W，頻率：50 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，6000 r·min-1離心(離心半徑3.5 cm)10 min，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液 按《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第一冊(cè)中風(fēng)熱感冒顆粒的處方，分別制備缺少苦杏仁、板藍(lán)根、桑葉、連翹、菊花和牛蒡子藥味的陰性樣品，并按2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

按2.1色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依法測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，不同的陰性供試品溶液中分別在與苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷對(duì)照品溶液的色譜圖中相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明處方中其他藥味對(duì)待測(cè)成分無(wú)干擾，方法的專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下6種對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mL，分別置20 mL量瓶中，并加甲醇定容，制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件依法測(cè)定。以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，表明各成分的線性關(guān)系良好。

注：A1～A3.混合對(duì)照品；B1～B3.風(fēng)熱感冒顆粒；C.缺苦杏仁陰性樣品；D.缺板藍(lán)根陰性樣品；E.缺桑葉陰性樣品；F.缺連翹陰性樣品；G.缺菊花陰性樣品；H.缺牛蒡子陰性樣品；1.苦杏仁苷；2.(R，S)-告依春；3.蘆?。?.連翹酯苷A；5.3，5-O-二咖啡?；鼘幩?；6.牛蒡苷。圖1 風(fēng)熱感冒顆粒HPLC圖

表1 風(fēng)熱感冒顆粒中6種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件依法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，并以不同成分的峰面積計(jì)算精密度，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍辗迕娣e的RSD分別為0.2%、0.3%、0.2%、0.1%、0.1%和0.2%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20180414)，按2.2.2項(xiàng)下方法，制備平行樣品溶液6份，按2.1色譜條件依法測(cè)定，并分別計(jì)算不同成分的含量，以平均含量(n=6)考察重復(fù)性，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍蘸康腞SD分別為0.7%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%和0.5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20180414)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按2.1色譜條件依次進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積考察精密度，苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和牛蒡苷峰面積的RSD分別為0.4%、0.5%、0.5%、0.3%、0.4%和0.5%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取一批已知指標(biāo)成分含量的樣品(批號(hào)：20180414)，每份稱(chēng)取5 g，精密稱(chēng)定，共稱(chēng)取9份，每3份為一組，分別精密加入0.5、1.0、1.5 μL苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍辗宓膶?duì)照品儲(chǔ)備液，照2.2.2項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，分別計(jì)算6種成分的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 風(fēng)熱感冒顆粒中6種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測(cè)定

分別取16批樣品，均按2.2.2項(xiàng)下方法各制備供試品溶液2份，按2.1項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，用外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中苦杏仁苷、(R，S)-告依春、蘆丁、連翹酯苷A、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷团］蜍辗宓暮?，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 風(fēng)熱感冒顆粒中6種成分的含量 μg·g-1

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

風(fēng)熱感冒顆粒由11味中藥成分組成，由于待測(cè)的6種成分紫外光譜差異較大，為了用1種方法能同時(shí)檢測(cè)6種活性成分，故采用HPLC-DAD，不同波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)各成分的含量。分析各成分的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，并分別參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部苦杏仁、板藍(lán)根、桑葉、連翹、菊花和牛蒡子項(xiàng)下含量測(cè)定方法，苦杏仁苷和牛蒡苷均在207 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，且分離度較好，無(wú)干擾峰出現(xiàn)，所以選擇207 nm作為其共同的測(cè)定波長(zhǎng)；(R，S)-告依春在245 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，并且無(wú)雜峰干擾，故選擇此波長(zhǎng)檢測(cè)；蘆丁、連翹酯苷A和3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸雖在207 nm處有較大吸收，但樣品中干擾較多，分離效果不好，在330 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，且無(wú)干擾，因此選擇330 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參照相關(guān)文獻(xiàn)[17-31]，比較了乙腈-水、乙腈-0.1%的磷酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%磷酸溶液4種不同的流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，峰形較好，且分離效果好。試驗(yàn)采用梯度洗脫，通過(guò)對(duì)乙腈和0.1%的磷酸溶液的比例進(jìn)行優(yōu)化，使得待測(cè)的6種成分保留時(shí)間適宜，分離效果較好，見(jiàn)圖1。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

分別以甲醇、50%甲醇和水為溶劑，并且分別采取超聲15、30、45 min提取，通過(guò)對(duì)比提取效果，顆粒在甲醇中溶解性差，部分待測(cè)成分在水中的溶解度較低，6種待測(cè)成分在50%甲醇中提取效果均較好，雜峰的干擾較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲30 min已提取完全。

3.4 樣品結(jié)果分析

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法測(cè)定結(jié)果專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于風(fēng)熱感冒顆粒的質(zhì)量控制。本研究檢測(cè)了8個(gè)不同廠家共16批樣品，發(fā)現(xiàn)同廠家的樣品差別較小，但不同廠家之間的樣品差別較大，且部分廠家的待測(cè)成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于理論值，甚至有的成分未檢出。分析原因認(rèn)為，主要為原料差異和工藝差別，也可能存在部分廠家未能按處方量投料的情況。風(fēng)熱感冒顆?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)未設(shè)含量測(cè)定項(xiàng)目，通過(guò)本研究建立的同時(shí)檢測(cè)風(fēng)熱感冒顆粒中6種活性成分的含量的方法，有助于提升對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。