HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定七制香附丸中7種成分的含量△

江華強(qiáng)，嚴(yán)鑄云

1.成都市德康醫(yī)院，四川 成都 610091；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075

七制香附丸由醋香附、白芍、酒萸肉、地黃等22味中藥加工而成，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部，主要用于氣滯血虛所致的痛經(jīng)、月經(jīng)量少、閉經(jīng)，癥見(jiàn)胸脅脹痛、經(jīng)行量少、行經(jīng)小腹脹痛、經(jīng)前雙乳脹痛、經(jīng)水?dāng)?shù)月不行等臨床病癥的治療[1]。方中香附疏肝解郁、行氣散結(jié)、調(diào)經(jīng)止痛，為其君藥；白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛，熟地黃、阿膠益精、補(bǔ)血養(yǎng)血，益母草、延胡索、川芎活血祛瘀、行氣止痛，艾葉、艾葉炭溫經(jīng)散寒止痛，共為臣藥；山茱萸補(bǔ)腎益精，茯苓、白術(shù)、人參、稻米健牌益氣、補(bǔ)氣生血，鮮牛乳溫中補(bǔ)虛，砂仁、小茴香溫中行氣，地黃、天冬、食鹽養(yǎng)陰涼血，黃芩清熱燥濕止帶，酸棗仁養(yǎng)血寧心安神，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為其使藥，諸藥共奏，以達(dá)疏肝解郁、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效?，F(xiàn)代研究表明，七制香附丸對(duì)子宮肌瘤[2]、產(chǎn)后便秘[3]、卵巢囊腫氣滯血瘀證[4-5]、輸卵管阻塞性不孕[6]等病癥臨床療效顯著?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)七制香附丸方中臣藥白芍所含芍藥苷進(jìn)行定量控制，中藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，各成分之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，單一成分難以全面評(píng)價(jià)七制香附丸的整體質(zhì)量，文獻(xiàn)報(bào)道中也僅對(duì)該制劑所含1～2個(gè)成分進(jìn)行定量測(cè)定研究[7-9]。本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，選取七制香附丸方中君藥醋香附所含主要化學(xué)成分香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮，臣藥白芍所含活性成分芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，佐藥山茱萸所含活性成分莫諾苷和馬錢(qián)苷為檢測(cè)指標(biāo)，采用HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定七制香附丸中7種成分含量，為七制香附丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和全面評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

e2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；BS110S型電子分析天平(德國(guó)Sartorious公司)。

對(duì)照品莫諾苷(批號(hào)：111998-201703，純度：97.4%)、芍藥苷(批號(hào)：110736-201943，純度：95.1%)、馬錢(qián)苷(批號(hào)：111640-201808，純度：99.0%)、α-香附酮(批號(hào)：110748-201815，純度：99.7%)均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品圓柚酮(批號(hào)：PRF8072622，純度：97.5%)購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)：18040323，純度：98.5%)、香附烯酮(批號(hào)：18051522，純度：95.5%)均來(lái)源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；七制香附丸(批號(hào)分別為181117、190102、190305)來(lái)源于河南潤(rùn)弘本草制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取對(duì)照品莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮各適量，用75%甲醇溶液制成含莫諾苷0.298 mg·mL-1、馬錢(qián)苷0.152 mg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷0.334 mg·mL-1、芍藥苷0.718 mg·mL-1、香附烯酮2.476 mg·mL-1、圓柚酮0.542 mg·mL-1、α-香附酮1.318 mg·mL-1的7種對(duì)照品儲(chǔ)備儲(chǔ)備液。

2.1.2混合對(duì)照品溶液 精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.5 mL，用75%甲醇制成含莫諾苷14.9 μg·mL-1、馬錢(qián)苷7.6 μg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷16.7 μg·mL-1、芍藥苷35.9 μg·mL-1、香附烯酮123.8 μg·mL-1、圓柚酮27.1 μg·mL-1、α-香附酮65.9 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3七制香附丸供試品溶液和陰性樣品溶液 取七制香附丸細(xì)粉約2.0 g，精密稱(chēng)定，精密加入75%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流提取60 min，擦干外壁，放冷，再稱(chēng)質(zhì)量，用75%甲醇溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得七制香附丸供試品溶液。按七制香附丸的處方工藝，分別制備缺山茱萸、缺白芍和缺香附的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專(zhuān)屬性試驗(yàn)

色譜柱：Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm[10-12]；以乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～10.0 min，9.0%A；10.0～22.0 min，9.0%～16.0%A；22.0～37.0 min，16.0%～21.0%A；37.0～61.0 min，21.0%～45.0%A；61.0～70.0 min，45.0%～9.0%A)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。取2.1.2～2.1.3項(xiàng)下溶液各10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果表明，七制香附丸供試品色譜圖基線平穩(wěn)，莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮峰形對(duì)稱(chēng)，分離度>1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均大于等于4000，陰性樣品對(duì)七制香附丸中莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮7種成分的同時(shí)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.七制香附丸；C.山茱萸陰性樣品；D.白芍陰性樣品；E.香附陰性樣品；1.莫諾苷；2.馬錢(qián)苷；3.芍藥內(nèi)酯苷；4.芍藥苷；5.香附烯酮；6.圓柚酮；7.α-香附酮 。圖1 七制香附丸混合對(duì)照品、樣品及陰性樣品HPLC圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用75%甲醇溶液制成6個(gè)含莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮25倍質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 七制香附丸中7種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度考察

取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮峰面積的RSD分別為1.11%、1.26%、0.98%、0.72%、0.53%、0.84%和0.67%。

2.5 重復(fù)性考察

取同一批次(批號(hào)：181117)七制香附丸樣品適量，平行制備6份七制香附丸供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計(jì)算各成分含量，結(jié)果各成分含量的RSD分別為1.63%、0.85%、1.46%、1.17%、0.94%、1.47%和1.21%。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一批次(批號(hào)：181117)七制香附丸樣品適量，臨用新配1份七制香附丸供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，結(jié)果七制香附丸供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定，各成分峰面積的RSD分別為1.09%、1.24%、0.95%、0.70%、0.56%、0.82%和0.65%。

2.7 回收率試驗(yàn)

取同一批次(批號(hào)：181117)已知成分含量的七制香附丸細(xì)粉9份，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮質(zhì)量濃度分別為0.087、0.043、0.125、0.259、0.896、0.155、0.447 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，使莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮對(duì)照品加入量約為樣品原有量的50%、100%和150%，再按上述方法制成加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 七制香附丸中7種化學(xué)成分含量測(cè)定

取3批七制香附丸樣品適量，按2.1.3項(xiàng)下方法每個(gè)批次平行制備3份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的峰面積，計(jì)算七制香附丸中7種化學(xué)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 七制香附丸中7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

續(xù)表2

表3 七制香附丸中7種成分的含量(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)七制香附丸中待測(cè)化學(xué)成分莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的不同性質(zhì)，為達(dá)到最佳的分離效果，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)不同流動(dòng)相體系(甲醇-水[13-14]、乙腈-水[15])進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果乙腈-水流動(dòng)相體系各成分分離效果較佳，但芍藥內(nèi)酯苷、莫諾苷色譜峰存在拖尾；遂在HPLC流動(dòng)相的水相中加入一定量的酸(0.1%甲酸[16]、0.1%冰乙酸、0.1%磷酸[17]、0.3%磷酸[18])進(jìn)行對(duì)比考察，并對(duì)流動(dòng)相比例不斷優(yōu)化，最終確定按照正文中流動(dòng)相及梯度洗脫程序?qū)ζ咧葡愀酵柚心Z苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮7種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，此流動(dòng)相體系下，所檢測(cè)色譜圖基線平穩(wěn)，待測(cè)化學(xué)成分莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮分離較好，峰形對(duì)稱(chēng)，靈敏度高。

3.2 供試品提取方式的優(yōu)化

在制備供試品溶液時(shí)，首先對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察，以七制香附丸中待測(cè)化學(xué)成分莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的綜合提取率及色譜圖雜質(zhì)數(shù)量等為指標(biāo)，參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比了提取溶劑(甲醇[12-15]、75%甲醇[16]、50%甲醇[17]、95%乙醇、75%乙醇[10-11])對(duì)考察指標(biāo)的影響，結(jié)果以75%甲醇為提取溶劑時(shí)，莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的綜合提取率最佳；遂又分別對(duì)提取方式(超聲提取法[12-14，16-18]、加熱回流法[11])進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，加熱回流提取各化學(xué)成分綜合提取率明顯高于超聲提取結(jié)果，可能與七制香附丸中7種待測(cè)目標(biāo)成分莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮來(lái)源藥材醋香附、白芍、山茱萸直接細(xì)粉入藥的生產(chǎn)工藝有關(guān)，同時(shí)對(duì)提取時(shí)間不斷摸索，最終選擇75%甲醇溶液加熱回流提取60 min對(duì)七制香附丸供試品進(jìn)行制備。

本研究首次采用HPLC梯度洗脫法對(duì)七制香附丸中莫諾苷、馬錢(qián)苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為更全面地評(píng)價(jià)七制香附丸的產(chǎn)品質(zhì)量，不斷提升七制香附丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。