一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定復(fù)明片中7種成分的含量

姚建華，趙博，王婧寧，趙志國，黃群*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧大熊制藥有限公司 研究所，遼寧 本溪 117004

復(fù)明片由酒萸肉、車前子、決明子、枸杞子、地黃等24味中藥加工而成，臨床上主要用于肝腎陰虛所致的羞明畏光、視物模糊，青光眼初、中期白內(nèi)障見上述證候的治療[1]。現(xiàn)代研究表明，復(fù)明片改善初發(fā)期老年性白內(nèi)障患者[2]、糖尿病視網(wǎng)膜病變患者[3]的視力水平，治療玻璃體混濁[4]、原發(fā)性開角型青光眼視功能[5-6]，改善中晚期青光眼術(shù)后眼底血液循環(huán)，提高視力[7]等臨床效果明顯。中藥及其制劑具有多組分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，單一組分控制模式難以全面評(píng)價(jià)其產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，多指標(biāo)控制模式近年來已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中。復(fù)明片現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)2015年版一部，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道中僅對(duì)復(fù)明片所含單一成分進(jìn)行定量控制，尚未建立復(fù)明片多組分質(zhì)量控制模式[8]。本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)明片中活性成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷含量，建立復(fù)明片多組分質(zhì)量控制模式，同時(shí)以莫諾苷為內(nèi)參物，建立其與其他6種成分的相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)法(QAMS)對(duì)復(fù)明片中7種活性成分含量的同時(shí)測(cè)定，有效地解決了傳統(tǒng)多指標(biāo)成分控制模式部分對(duì)照品不易得、價(jià)格昂貴、檢驗(yàn)成本過高的不足，為進(jìn)一步完善復(fù)明片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和全面反映復(fù)明片的產(chǎn)品質(zhì)量提供支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Prominence型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB265-S型電子天平(瑞士Mettler-Toledo儀器有限公司)。

1.2 試藥

莫諾苷對(duì)照品(批號(hào)：111998-201703，CAS號(hào)：25406-64-8，純度：97.4%)、馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)：111640-201808，CAS號(hào)：18524-94-2，純度：99.0%)、大車前苷對(duì)照品(批號(hào)：111914-201604，CAS號(hào)：104777-68-6，純度：90.2%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷對(duì)照品(批號(hào)：CFS201701，CAS號(hào)：24577-90-0，純度：98.0%)、決明子苷對(duì)照品(批號(hào)：CFS201702，CAS號(hào)：123914-49-8，純度：98.0%)均來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：PRF8062622，CAS號(hào)：129025-96-3，純度：99.5%)、山茱萸新苷對(duì)照品(批號(hào)：14082202，CAS號(hào)：131189-57-6，純度：97.8%)均來源于成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

復(fù)明片(規(guī)格：0.31 g/片，批號(hào)分別為PC218110591、PC219030101、PC219040171)來源于于西安碑林藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取7種待測(cè)目標(biāo)成分對(duì)照品適量，用60%甲醇溶液制成紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷1.052 mg·mL-1、大車前苷0.176 mg·mL-1、莫諾苷1.126 mg·mL-1、決明子苷0.754 mg·mL-1、馬錢苷0.572 mg·mL-1、山茱萸新苷0.126 mg·mL-1、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷0.438 mg·mL-1的7種對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2混合對(duì)照品溶液 精密吸取2.1.1項(xiàng)下7種對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.5 mL，用60%甲醇制成紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷52.6 μg·mL-1、大車前苷8.8 μg·mL-1、莫諾苷56.3 μg·mL-1、決明子苷37.7 μg·mL-1、馬錢苷28.6 μg·mL-1、山茱萸新苷6.3 μg·mL-1、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷21.9 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3復(fù)明片供試品溶液 取復(fù)明片樣品(批號(hào)：PC218110591)適量，除去薄膜衣，研成細(xì)粉，取2.0 g，精密稱定，精密加入60%甲醇25 mL，加熱回流提取60 min，取出放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，制成復(fù)明片供試品溶液。

2.1.4陰性樣品溶液 按《中國藥典》2015年版一部復(fù)明片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方比例和制法，分別制備缺車前子、缺決明子、缺酒萸肉的3種陰性樣品，再按2.1.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為330 nm[9-11](0～17.0 min檢測(cè)大車前苷)、278 nm[12](17.0～36.0 min檢測(cè)紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷)和240 nm[13-15](36.0～65.0 min檢測(cè)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～11.0 min，15.0%A；11.0～17.0 min，15.0%～19.0%A；17.0～36.0 min，19.0%～25.0%A；36.0～57.0 min，25.0%～41.0%A；57.0～65.0 min，41.0%～15.0%A)；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。精密吸取2.1.2～2.1.4項(xiàng)下制備的各溶液依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄所檢測(cè)色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，復(fù)明片中7種待測(cè)目標(biāo)成分與其他雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均不低于4500，陰性樣品對(duì)復(fù)明片中7種成分的同時(shí)測(cè)定無干擾。

注：A.混合對(duì)照品；B.復(fù)明片；C.車前子陰性樣品；D.決明子陰性樣品；E.酒萸肉陰性樣品；1.大車前苷；2.紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷；3.決明子苷；4.橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷；5.莫諾苷；6.馬錢苷；7.山茱萸新苷。圖1 混合對(duì)照品及復(fù)明片的HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下7種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用60%甲醇溶液制成紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷25倍質(zhì)量濃度差的6個(gè)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄待測(cè)目標(biāo)成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗(yàn)

取2.1.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰峰面積的RSD分別為0.94%、1.28%、0.65%、1.03%、1.05%、1.36%和1.17%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備同一批次復(fù)明片(批號(hào)：PC218110591)樣品6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰的峰面積，計(jì)算得7種待測(cè)成分含量的RSD分別為1.16%、1.71%、0.98%、0.35%、1.64%、0.87%和1.59%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

臨用新配1份復(fù)明片(批號(hào)：PC218110591)供試品溶液，于制備后0、2、4、8、12、24 h依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰的峰面積，結(jié)果復(fù)明片供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，各成分峰面積的RSD分別為1.01%、1.29%、0.62%、1.08%、0.98%、1.33%和1.15%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷含量已知的復(fù)明片(批號(hào)：PC218110591)樣品適量，除去薄膜衣，研細(xì)，取9份，每份1.0 g，精密稱定，隨機(jī)分成3組，依據(jù)《中國藥典》2015年版四部對(duì)加樣回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)的要求，分別精密加入根據(jù)供試品溶液含量另行配制的混合對(duì)照品溶液(紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷0.397 mg·mL-1、大車前苷0.049 mg·mL-1、莫諾苷0.435 mg·mL-1、決明子苷0.256 mg·mL-1、馬錢苷0.197 mg·mL-1、山茱萸新苷0.037 mg·mL-1、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷0.128 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL各1組，再按2.1.3項(xiàng)下方法制備加樣樣品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果所測(cè)成分大車前苷、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷的平均加樣回收率及RSD分別為99.02%(1.21%)、97.43%(1.09%)、100.11%(0.64%)、98.49%(0.76%)、97.96%(1.19%)、96.98%(1.15%)和98.40%(1.51%)。

表1 復(fù)明片7種成分線性關(guān)系和范圍

2.8 相對(duì)校正因子的測(cè)定

精密吸取2.3項(xiàng)下6個(gè)混合對(duì)照品溶液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰的峰面積，以莫諾苷為內(nèi)參物，按照公式(1)分別計(jì)算其他6種成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

fk/s=fk/fs=(Ck×As)/(Cs×Ak)

(1)

式中C代表質(zhì)量濃度，A代表峰面積，k代表內(nèi)參物，s代表其他目標(biāo)成分。

2.9 相對(duì)校正因子耐用性考察

2.9.1不同儀器、色譜柱 取2.1.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣測(cè)定復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰的峰面積，對(duì)比考察Agilent 1100型、Shimadzu Prominence型2種品牌高效液相色譜儀和Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Shimadzu wondasil C18-WR(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種型號(hào)色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3。

2.9.2不同體積流量 取2.1.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣，測(cè)定復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷色譜峰的峰面積，對(duì)比考察不同體積流量(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4。

表2 以莫諾苷為內(nèi)參物的相對(duì)校正因子

表3 不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.9.3待測(cè)組分色譜峰的定位 以內(nèi)參物莫諾苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對(duì)保留時(shí)間值法考察在不同儀器、不同色譜柱條件下其他待測(cè)6種成分與內(nèi)參物莫諾苷的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表5。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批復(fù)明片樣品(批號(hào)分別為：PC218110591、PC219030101、PC219040171)依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄復(fù)明片中待測(cè)目標(biāo)成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷峰面積，分別采用外標(biāo)法(ESM)和QAMS計(jì)算紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷的含量，結(jié)果見表6。

表4 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表5 不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

表6 復(fù)明片7種成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的確定

復(fù)明片由酒萸肉、車前子、決明子、枸杞子、地黃等24味中藥配伍而成，方中酒萸肉、枸杞子、菟絲子滋補(bǔ)肝腎、生精明目，女貞子、熟地黃、地黃補(bǔ)腎滋陰、益肝養(yǎng)血，石斛滋陰生津，合為君藥；附以決明子清熱明目，木賊、谷精草疏散風(fēng)熱、明目退翳，黃連、夏枯草清肝瀉火、明目消腫，菊花平肝明目，牡丹皮清熱涼血，車前子清利濕熱，木通利尿通淋、清心除煩，羚羊角、蒺藜、石決明平肝潛陽、清熱開郁，澤瀉利濕泄熱，茯苓健脾滲濕，檳榔下氣行水，人參、山藥健脾補(bǔ)氣，諸藥共奏，以達(dá)滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰生津、清肝明目之功效。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為首選，兼顧臣佐使藥的選定原則，選取復(fù)明片方中君藥酒萸肉所含主要活性成分莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷，臣藥決明子所含特征成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷，佐藥車前子所含主要成分大車前苷為定量測(cè)定目標(biāo)成分，為全面評(píng)價(jià)復(fù)明片的產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

3.2 色譜條件流動(dòng)相的確定

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)流動(dòng)相乙腈-水[8]、甲醇-水[14]進(jìn)行考察，以復(fù)明片待測(cè)目標(biāo)成分大車前苷、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷色譜峰的峰形、分離效果、色譜圖基線平穩(wěn)情況及檢測(cè)時(shí)間等為考察指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)綜合效果較好，但鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷、莫諾苷和馬錢苷色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，遂以乙腈為有機(jī)相，對(duì)比考察了不同水相(0.1%磷酸溶液[13，15-16]、0.1%甲酸溶液[10-11])對(duì)考察指標(biāo)的影響，同時(shí)對(duì)梯度洗脫比例不斷摸索，最終確定采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，按照正文中的流動(dòng)相比例進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)復(fù)明片中7種指標(biāo)性成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)首次采用QAMS對(duì)復(fù)明片中紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、大車前苷、莫諾苷、決明子苷、馬錢苷、山茱萸新苷和橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，建立了復(fù)明片多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為全面評(píng)價(jià)復(fù)明片的產(chǎn)品質(zhì)量提供了數(shù)據(jù)支持。