生 鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠體內(nèi)的組織分布△

唐雅楠，許金凱，韓喜桃，韓舒，劉凱洋，支美汝，劉子琴，李衛(wèi)飛，李飛，杜紅

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

知母來源于百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、生津潤燥的功效[1]。鹽知母是知母歷代的主流炮制品種，傳統(tǒng)理論認(rèn)為，鹽炙可引藥入腎[2]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道也表明，知母鹽炙后滋陰降火作用增強(qiáng)[3-8]。

芒果苷是知母有效成分之一，也是《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定的質(zhì)量控制成分之一[9]，具有抗炎[10-15]、保護(hù)腎功能[16-18]、增強(qiáng)免疫力[19-20]、抗病毒[21]、抗氧化[22-23]等作用。在炮制過程中，利用輔料與藥物相輔或相制的性味，可達(dá)到調(diào)整藥性、引藥歸經(jīng)、影響藥物作用趨向、增強(qiáng)臨床療效的目的。陳嘉謨?cè)凇侗静菝审堋分杏涊d：“酒制升提，姜制發(fā)散，入鹽走腎臟仍仗軟堅(jiān)……”[24]，明確提出鹽炙入腎理論。本實(shí)驗(yàn)通過研究生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠體內(nèi)的組織分布，以期從輔料作用論角度探討知母鹽炙后滋陰降火作用增強(qiáng)的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，40只，雄性，體質(zhì)量(200±20) g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0038]，室溫(25±2) ℃，相對(duì)濕度為45%，12 h/12 h 光暗周期。實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試藥

知母飲片購于北京雙橋燕京飲片廠，批號(hào)：1611103558，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定與資源系王晶娟副教授鑒定為百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖。鹽知母為本實(shí)驗(yàn)室自制，工藝條件為取知母飲片100 g，加鹽水拌勻，悶透，在160～170 ℃條件下炒制20 min。每100 kg知母片用食鹽2 kg。

對(duì)照品芒果苷(上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：Y26M8H369263，純度≥98%)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；甲醇、冰乙酸(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1901013202)；水為超純水。

1.3 儀器

2965型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；BY-R20型高速冷凍低溫離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；FA1104B型分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；ISO9001型十萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；VORJEK5型渦旋震蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；MTN-5800型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SunFire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脫(0～8 min，15%～25%A；8～12 min，25%A；12～15 min，25%～80%A；15～20 min，80%～15%A；20～25 min，15%A)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒果苷對(duì)照品1.02 mg，于10 mL量瓶中用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為102 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量芒果苷對(duì)照品溶液，用甲醇水溶液(40∶60)稀釋，得到質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的對(duì)照品稀釋液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2供試品溶液的制備 芒果苷混懸液：取CMC-Na適量，加入一定量水，混勻，得到0.5%的CMC-Na混懸液。精密稱取芒果苷0.5 g，加入CMC-Na混懸液定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的芒果苷混懸液。

知母水煎液：取生知母和鹽知母各100 g，10倍量水浸泡30 min后加熱回流 1 h，4層紗布濾過后，藥渣加8倍量水同法得二次濾液，合并藥液，濃縮，得以生藥量計(jì)質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的生、鹽知母水煎液(以芒果苷計(jì)分別為6.4、9.7 mg·mL-1)。

2.3 組織樣品收集

SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、芒果苷(200 mg·kg-1)組、生知母(10 g·kg-1)組、鹽知母(10 g·kg-1)組，每組10只，灌胃給藥前禁食12 h，可自由飲水，分別灌胃給予水、芒果苷混懸液、生知母水煎液和鹽知母水煎液，給藥量為10 mL·kg-1。灌胃2 h后處死，迅速取出肝、心、脾、肺、腎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，濾紙擦干。精密稱取各組織0.5 g，用0.9%氯化鈉溶液制成25%組織勻漿，于-80 ℃下保存。

2.4 組織樣品處理

精密吸取200 μL組織勻漿于2 mL離心管中，加入600 μL乙腈乙酸溶液(40∶1)，充分振蕩1 min，4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為8.5 cm)，取上清液，35 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL甲醇水溶液(40∶60)復(fù)溶，離心，上清液濾過后進(jìn)HPLC檢測。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1專屬性考察 取大鼠空白腎組織勻漿液、含芒果苷空白腎組織勻漿液、灌胃生知母水煎液后腎組織勻漿液，按2.4項(xiàng)下方法處理，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。色譜峰峰形良好，無雜峰干擾測定，專屬性良好。

注：A.空白腎組織；B.含芒果苷空白腎組織；C.灌胃生知母水煎液后腎組織。圖1 大鼠腎組織中芒果苷色譜圖

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品稀釋液5.14、10.53、22.22、50.00、85.72、133.34、200.00 μL及對(duì)照品溶液6.18、12.78 μL，加入大鼠各空白組織勻漿200 μL，得質(zhì)量濃度約為50、100、200、400、600、800、1000、3000、6000 ng·mL-1的系列組織勻漿樣品。按2.4項(xiàng)下方法處理，2.1項(xiàng)下色譜條件檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各回歸方程見表1，芒果苷在各組織勻漿中線性范圍為50～6000 ng·mL-1，定量下限為50 ng·mL-1，且線性關(guān)系良好，r≥0.999 3。

表1 芒果苷在大鼠各組織中的線性關(guān)系

2.6.3精密度和準(zhǔn)確度考察 按2.6.2項(xiàng)下方法操作，每日制備含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠組織勻漿各6份，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，連續(xù)測定3 d。精密度以日內(nèi)質(zhì)量濃度和日間質(zhì)量濃度的RSD表示，準(zhǔn)確度以測得的實(shí)際質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度的比值表示。結(jié)果顯示，各組織勻漿中芒果苷測定的準(zhǔn)確度在89.59%～101.11%，日內(nèi)精密度的RSD≤8.65%，日間精密度的RSD≤13.84%。

2.6.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察 按2.6.2項(xiàng)下方法操作，制備含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠組織勻漿各6份，按照2.4項(xiàng)下方法處理，2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測，得到峰面積A1。取空白組織勻漿200 μL，按2.4項(xiàng)下方法操作至氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)煤?、中、?個(gè)質(zhì)量濃度芒果苷的甲醇水溶液(40∶60)復(fù)溶，按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測，得到峰面積A2。直接用含低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度芒果苷的甲醇水溶液進(jìn)樣分析，得峰面積A3。按照公式(1)～(2)計(jì)算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

提取回收率=A1/A2×100%

(1)

基質(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%

(2)

結(jié)果顯示，提取回收率為58.06%～95.46%，RSD<15%，基質(zhì)效應(yīng)為71.43%～103.03%，RSD<12%，表明測定方法提取回收率良好，無基質(zhì)干擾。

2.6.5穩(wěn)定性考察 取含有低、中、高質(zhì)量濃度(50、600、6000 ng·mL-1)芒果苷的大鼠空白組織勻漿，按照2.4項(xiàng)下方法處理，考察樣品在室溫下放置3、24 h和凍融3次的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，各條件下各組織勻漿中芒果苷的穩(wěn)定性為89.18%～105.06%，RSD<11%，表明芒果苷在各條件下穩(wěn)定性較好。

2.7 芒果苷組織分布結(jié)果

灌胃芒果苷混懸液2 h后，大鼠各組織中芒果苷含量為肺>腎>脾>心≈肝。灌胃生、鹽知母水煎液2 h后，大鼠各組織中芒果苷含量為肺>腎>脾>肝>心(圖2)。生、鹽知母水煎液組與芒果苷組的分布規(guī)律相同，符合知母的歸經(jīng)特點(diǎn)。生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠各組織中的含量均高于芒果苷組，但生、鹽知母水煎液中芒果苷在大鼠各組織中的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與芒果苷組對(duì)應(yīng)組織比較，*P<0.05。圖2 芒果苷組及生、鹽知母水煎液組大鼠各組織中芒果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了給予生、鹽知母水煎液和芒果苷混懸液后大鼠體內(nèi)芒果苷在各組織的分布情況，結(jié)果表明，芒果苷主要分布在肺、腎中，該結(jié)論與知母的歸經(jīng)特點(diǎn)一致。芒果苷在肺、腎組織中的含量依次為鹽知母水煎液≈生知母水煎液>芒果苷混懸液。由灌胃劑量可知，芒果苷組的灌胃劑量(以芒果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))分別是生、鹽知母組的3.1、2.1倍(實(shí)驗(yàn)用飲片中生知母芒果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.64%，鹽知母芒果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.97%)，其芒果苷在各組織中的含量卻顯著小于生、鹽知母組，一方面可能是由于飲片在煎煮過程中促進(jìn)芒果苷溶出或產(chǎn)生其他成分向芒果苷轉(zhuǎn)化，使水煎液中芒果苷含量增加；另一方面，中藥飲片中化學(xué)成分復(fù)雜，其他成分可能促進(jìn)了芒果苷的溶出和吸收。鹽知母組大鼠腎臟組織中的芒果苷含量與生知母組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明單以芒果苷的分布闡明鹽炙入腎的炮制理論尚沒有充分的科學(xué)依據(jù)，知母鹽炙后增強(qiáng)滋腎陰作用及作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。