山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中優(yōu)良產(chǎn)酸菌株的篩選及鑒定

邢曉瑩，劉毅，張懷敏，李江涌，王如福*

1(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 晉中，030801)2(太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中，030619) 3(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷，030801)

傳統(tǒng)食醋釀造法主要有固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法，固態(tài)發(fā)酵法以中國的山西老陳醋[1]、鎮(zhèn)江香醋[2]和四川麩醋[3]為代表，液態(tài)發(fā)酵法以意大利香醋[4]、西班牙雪利醋[5]等為代表。不同釀造工藝釀制而成的食醋風(fēng)味也有較大差異。液態(tài)深層發(fā)酵工藝釀制的食醋，由于使用純種的醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵，食醋中的有機(jī)酸種類、風(fēng)味物質(zhì)等相對單一，產(chǎn)酸以乙酸為主，風(fēng)味物質(zhì)主要是乙酸乙酯，產(chǎn)品酸味刺鼻、風(fēng)味寡淡[6]。固態(tài)發(fā)酵食醋多采用開放式的發(fā)酵工藝，主要釀造微生物除醋酸菌外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等，它們經(jīng)代謝直接產(chǎn)生或其代謝物通過合成作用形成多種物質(zhì)，如醇類、酯類、有機(jī)酸、醛類、烯萜類等，不同的香氣物質(zhì)組合在一起，共同賦予了食醋復(fù)雜而獨特的風(fēng)味[7-10]。

山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中的微生物大都具有特定的功能，通過微生物的代謝作用產(chǎn)生眾多的食醋風(fēng)味物質(zhì)，為成品食醋特有風(fēng)味的形成提供必要的基礎(chǔ)，如醋酸菌可將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，是山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的主要產(chǎn)酸微生物，其性能直接影響到食醋的產(chǎn)量和品質(zhì)。酸味是山西老陳醋的主要呈味物質(zhì)，成品食醋的主體成分除乙酸外還有乳酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸，而這些物質(zhì)與乳酸菌有密不可分的關(guān)系。本研究以山西老陳醋的醋醅為樣品，從中分離出產(chǎn)酸微生物，并對產(chǎn)酸性能優(yōu)良、環(huán)境耐受性好的菌株進(jìn)行篩選，為將來通過多種微生物菌劑優(yōu)化食醋生產(chǎn)工藝、提高原料利用率、豐富食醋釀造的菌種資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集地點：山西老陳醋集團(tuán)有限公司醋化車間(山西，晉中)。

采樣方法：在發(fā)酵缸的4個頂點以及中心位置，采集距離醋酸發(fā)酵缸表面20 cm處的醋醅100 g左右。跟蹤采集同批次5個發(fā)酵缸的醋醅樣本，并將其充分混勻，然后通過四分法舍去多余的醋醅，最終將300～500 g醋醅樣品收集于已滅菌的自封袋中，冷藏帶回實驗室后進(jìn)行產(chǎn)酸菌株的分離。

采樣設(shè)計：如表1所示，跟蹤取樣同一批次正常發(fā)酵的醋醅，發(fā)酵周期9 d，隔天在翻醅后取樣，分別標(biāo)記為AAF1、AAF3、AAF5、AAF7、AAF9。

1.2 試劑與儀器

MRS瓊脂培養(yǎng)基、無水葡萄糖、酵母膏、無水乙醇、瓊脂、濃鹽酸、CaCO3、NaOH、NaCl,所用試劑均為分析純。

表1 山西老陳醋醋醅樣品的采集時間及其編號Table 1 Sampling time and number at acetic acid fermentation stages of Shanxi aged vinegar

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；DL-CJ-1ND型無菌超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾濱儀器設(shè)備有限公司；LS-35LJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZQPL-200型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞設(shè)備有限公司；Nano Drop 2000c核酸濃度測定儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；UVP凝膠成像系統(tǒng)， 英國Ultra-Violet Products有限公司；5424高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；7500實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；CX41生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)酸菌的分離、純化[11]

取10 g混勻樣品放入裝有玻璃珠和已滅菌的90 mL無菌生理鹽水的三角瓶(250 mL)中，振蕩20 min，即得到樣品10-1稀釋液，取5支已滅菌裝有9 mL無菌生理鹽水的試管，依次制成10-2～10-6稀釋液，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的稀釋液0.1 mL，涂布于篩選培養(yǎng)基上(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%葡萄糖、1%酵母膏、2%CaCO3、2%瓊脂，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min后加入體積分?jǐn)?shù)3%的無水乙醇)。將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，挑取長勢良好、分布密度大且形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化。將經(jīng)過2～3次純化后的菌株接種于斜面培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，置于4 ℃冰箱中保存。對于需要長期保藏的菌株，可采用安瓿管甘油-70 ℃保藏法。

1.3.2 產(chǎn)酸定量試驗

1.3.2.1 醋酸菌

以惡臭醋酸桿菌(Acetobacterrancens)AS1.41為對照菌株，采用酸堿滴定法[12]對分離獲得的醋酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸量(以醋酸計)測定，3次重復(fù)，取平均值，同時做空白滴定。酒精轉(zhuǎn)化率計算[13]如公式(1)所示：

(1)

式中：產(chǎn)酸量，g/L；酒精的體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度計算，g/L。

1.3.2.2 乳酸菌

乳酸菌的產(chǎn)酸量測定方法同醋酸菌。

1.3.3 環(huán)境耐受性試驗

將100 mL產(chǎn)酸培養(yǎng)基分裝250 mL錐形瓶中，按2%接種量接種初篩得到的6株醋酸菌，設(shè)置不同的溫度梯度(30、33、36、39、42 ℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(4、6、8、10、12%)和乙酸質(zhì)量濃度(0、10、20、30、40、50、60 g/L)，130 r/min培養(yǎng)6 d，測定菌株的生物量OD600和相應(yīng)產(chǎn)酸量。每個梯度重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

醋酸菌在分離及保藏過程中容易發(fā)生突變，故需對其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗。將初選菌株在平板上連續(xù)傳代6次，觀察菌落形態(tài)和個體特征。將各代菌株同時接種到乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)6 d，測定發(fā)酵液的產(chǎn)酸量(以醋酸計)，計算轉(zhuǎn)酸率，重復(fù)3次。

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min，冷卻后加入體積分?jǐn)?shù)6%的無水乙醇。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4.5，121 ℃滅菌15 min。

1.3.5 菌種形態(tài)鑒定

(1)觀察菌落形態(tài)，記錄各菌株的菌落形態(tài)特征。

(2)將菌種進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌種的菌體形態(tài)。

1.3.6 菌種分子生物學(xué)鑒定

對細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行測序，從而鑒定優(yōu)勢菌株的種、屬。將菌株的16S rDNA基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，使用NCBI的BLAST檢測系統(tǒng)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對序列同源性進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸微生物的分離、純化

恒溫培養(yǎng)48～72 h后，菌落的生長情況如圖1所示。隨著稀釋倍數(shù)的增加，培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)逐漸減少，當(dāng)稀釋倍數(shù)為10-5時，產(chǎn)酸菌較為明顯且多為單菌落。此時將平板上出現(xiàn)溶鈣圈的單個菌落接入培養(yǎng)基，進(jìn)行2～3純化后，共獲得54株產(chǎn)酸菌，其中醋酸菌22株、乳酸菌32株，保藏備用。

a-產(chǎn)酸菌株的分離篩選；b-產(chǎn)酸菌株的純化圖1 產(chǎn)酸微生物的分離純化Fig.1 Isolation and purification of acid-producing microorganisms

2.2 醋酸菌的產(chǎn)酸性能測定

醋酸菌株產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)酸率結(jié)果見表2，各菌株的產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)酸率差別較大，菌株A14的酒精轉(zhuǎn)化率最高，為57.49%，轉(zhuǎn)酸率最低的是菌株A1，為37.08%。22株醋酸菌中有10株菌的產(chǎn)酸能力高于對照菌株。對產(chǎn)酸量在30.00 g/L以上的6株菌(A5、A10、A14、A16、A18、A20)進(jìn)行環(huán)境耐受性分析。

表2 各醋酸菌株的產(chǎn)酸量及酒精轉(zhuǎn)化率比較Table 2 The comparison of acid producing and alcohol conversion rate between different AAB strains

2.3 醋酸菌的環(huán)境耐受性分析

在一定的范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度的上升會有利于醋酸菌的生長和代謝，而溫度過高則會使醋酸菌產(chǎn)酶能力降低甚至喪失，從而導(dǎo)致產(chǎn)酸下降[14]。圖2-a顯示，隨著培養(yǎng)溫度的上升，6株醋酸菌的吸光度值呈現(xiàn)出3種變化趨勢，即A14、A20先保持平穩(wěn)后快速下降，A5、A16先略微升高后快速下降，A10、A18先快速下降后保持平穩(wěn)。由圖2-b可知，菌株A14的產(chǎn)酸量最高且溫度耐受性較好，在42 ℃的培養(yǎng)溫度中，其產(chǎn)酸量仍能達(dá)到(26.54±0.05)g/L，其次為菌株A16和A20。A18的最適發(fā)酵溫度為30 ℃，其他5株菌在培養(yǎng)溫度為33 ℃時產(chǎn)酸量最大。

酒精度耐受試驗發(fā)現(xiàn)，初篩醋酸菌的OD值隨著酒精濃度的上升均呈較緩慢的降低趨勢(圖2-c)。各菌株的產(chǎn)酸量隨著乙醇濃度增長，表現(xiàn)出不同的變化。菌株A5、A14和A18的產(chǎn)酸量先增加，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)6%和8%時達(dá)到最大，之后產(chǎn)酸量下降(圖2-d)。其他3株菌隨著乙醇濃度的增加，產(chǎn)酸量呈下降趨勢，說明A10、A16及A20的酒精耐受性較差。當(dāng)發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%時，6株菌可以存活，但其代謝受到明顯的抑制，基本不生成酸。

過酸和堿性的環(huán)境都會導(dǎo)致相關(guān)酶活性下降，從而影響醋酸菌的生長和產(chǎn)酸能力[15]。隨著培養(yǎng)液中乙酸濃度的上升，初篩菌株的OD600值均逐漸減小(圖2-e)。釀醋生產(chǎn)過程中，發(fā)酵液中的總酸含量會隨醋酸發(fā)酵進(jìn)程而逐漸升高，從而對參與發(fā)酵的微生物產(chǎn)生一定抑制作用。圖2-f顯示，當(dāng)發(fā)酵液中的乙酸含量超過3.0 g/100mL，6株醋酸菌仍然存活但產(chǎn)酸能力均明顯減弱，與謝錦明等[16]陜西民間醋醅中篩選的醋酸菌耐酸性基本一致；當(dāng)發(fā)酵液中的乙酸含量達(dá)到6.0 g/100mL，醋酸菌基本停止繁殖及代謝活動。

2.4 醋酸菌的遺傳穩(wěn)定性

由表3可以看出，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，各菌株每代的產(chǎn)酸量均發(fā)生變化。菌株A20各代發(fā)酵后的轉(zhuǎn)酸率均有降低，且變化幅度較大；而菌株A14各代之間的產(chǎn)酸率沒有明顯的差異，遺傳性能較穩(wěn)定。綜上，確定菌株A14為醋酸發(fā)酵優(yōu)勢菌種。

2.5 乳酸菌的產(chǎn)酸性能測定

由表4可知，32株乳酸菌的產(chǎn)酸量差異明顯，其中菌株L14的產(chǎn)酸量最高，為(9.94±0.34)g/L；而菌株L8的產(chǎn)酸能力最差，僅(0.83±0.01)g/L。試驗比較發(fā)現(xiàn)，乳酸菌代謝產(chǎn)物乳酸的生成量要遠(yuǎn)低于醋酸菌轉(zhuǎn)化乙醇生成醋酸的量，說明AAF階段，醋酸菌的數(shù)量雖然不及乳酸菌多，但其具有較高的轉(zhuǎn)酸率，發(fā)酵液中乙酸的積累速度快于乳酸的積累速度。對產(chǎn)酸量高于9.00 g/L的菌株L4、L19、L11和L20進(jìn)行環(huán)境耐受性分析。

2.6 乳酸菌的環(huán)境耐受性分析

圖3-a的結(jié)果顯示，初篩獲得的4株乳酸菌對溫度的反應(yīng)大體相同，其吸光度值在渡過一個平穩(wěn)期后均隨著溫度的上升呈逐漸下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30～40 ℃，OD600值基本保持不變；當(dāng)溫度超過40 ℃后，其繁殖及代謝開始受到抑制。通過溫度耐受性測試，發(fā)現(xiàn)菌株L9和L11的溫度耐受性較好，在50 ℃的環(huán)境中仍然保持相對較高的產(chǎn)酸能力(圖6-b)，初篩乳酸菌的最適產(chǎn)酸溫度均為35 ℃。

a-不同溫度梯度菌株的生物量;b-不同溫度梯度菌株的產(chǎn)酸量;c-不同乙醇濃度菌株的生物量;d-不同乙醇濃度菌株的產(chǎn)酸量;e-不同乙酸含量菌株的生物量;f-不同乙酸含量菌株的產(chǎn)酸量圖2 六株醋酸菌菌株的環(huán)境耐受性Fig.2 Environmental tolerance of six AAB strains

表3 傳代菌種產(chǎn)酸量 單位：g/L

圖3-c和圖3-d是初篩乳酸菌對乙醇的耐受性測試結(jié)果，菌株L4及L20受乙醇的影響較大。與不含乙醇的發(fā)酵條件相比，當(dāng)培養(yǎng)液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時，這2株菌的乳酸生成量分別降低了37.22%和43.36%。體積分?jǐn)?shù)3%的乙醇對L9的產(chǎn)酸能力基本沒有影響，當(dāng)培養(yǎng)液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%時，菌株L9和L11的乳酸生成量分別降低了25.94%和30.13%，具有較好的乙醇耐受能力。

圖3-e和圖3-f顯示的是乳酸菌對乙酸的耐受性結(jié)果，4株乳酸菌對乙酸的存在較為敏感、耐受能力均較差，當(dāng)發(fā)酵液中乙酸的含量超過2.0 g/100 mL后，乳酸菌的繁殖和代謝基本停止。4株菌中，L9的乙酸耐受性最好，初始產(chǎn)酸量為(9.56±0.25)g/L，隨著發(fā)酵液乙酸含量的升高，其產(chǎn)酸量迅速下降，當(dāng)發(fā)酵液中的乙酸質(zhì)量濃度為5.0 g/100mL，其產(chǎn)酸量僅為(1.54±0.01)g/L，代謝基本停止。綜上，篩選出的優(yōu)良產(chǎn)酸菌株為醋酸菌A14和乳酸菌L9。

表4 不同乳酸菌的產(chǎn)酸量比較 單位：g/L

a-不同溫度梯度菌株的生物量;b-不同溫度梯度菌株的產(chǎn)酸量;c-不同乙醇濃度菌株的生物量;d-不同乙醇濃度菌株的產(chǎn)酸量;e-不同乙酸含量菌株的生物量;f-不同乙酸含量菌株的產(chǎn)酸量圖3 四株乳酸菌菌株的環(huán)境耐受性Fig.3 Environmental tolerance of four LAB strains

2.7 菌株A14和L9的鑒定

2.7.1 菌落形態(tài)

如圖4所示，在平板培養(yǎng)基中，醋酸菌菌落呈白色，圓形，中間有凸起，菌落直徑0.32～1.02 mm，周圍有明顯的透明圈；乳酸菌菌落呈白色，圓形，菌落直徑0.58～3.07 mm，中間有凸起，表面有光澤。

a-A14；b-L9圖4 菌株A14和L9的菌落形態(tài)Fig.4 The colony morphology of A14 strain and L9 strain

2.7.2 菌體形態(tài)

對分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5所示。菌株A14經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，陰性，微生物顯微形態(tài)呈桿形，周邊無芽孢，以單個或成對方式排列；而菌株L9革蘭氏染色后呈紫色，陽性，微生物菌體形態(tài)呈球狀，對生或成鏈狀排列，周邊無芽孢。

2.7.3 16S rDNA鑒定

對篩選出來的2株菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列分析鑒定，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將待測序菌株的PCR產(chǎn)物純化后送至上海生工有限公司進(jìn)行序列分析，待測序結(jié)果出來后，將其序列提交到NCBI基因庫，通過BLAST程序進(jìn)行堿基同源序列檢索，對菌株進(jìn)行同源性比較。表5的比對結(jié)果表明菌株A14與巴氏醋桿菌(AcetobacterpasteurianusCP021922.1)的同源性為99.85%，L9與戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusJN039348.1)同源性為100%。結(jié)合菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和16S rDNA技術(shù)手段，鑒定菌株A14為A.pasteurianus，L9為P.pentosaceus。

表5 目標(biāo)菌株比對情況Table 5 Phylogenetic identification of target strains

3 討論

在對分離到的乳酸菌和醋酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸性能的測試過程中，發(fā)現(xiàn)醋酸菌的產(chǎn)酸能力明顯高于乳酸菌，分離醋酸菌株的最低產(chǎn)酸量為(22.90±0.21)g/L，而乳酸菌中最高能產(chǎn)酸(9.94±0.34)g/L，產(chǎn)酸能力最差的僅(0.83±0.01)g/L。這說明在醋酸發(fā)酵階段，雖然乳酸菌的豐度遠(yuǎn)高于醋酸菌，但醋醅中總酸的快速上升主要是由于乙酸的積累，而不是乳酸的原因。同時，乳酸菌對乙酸較敏感，耐酸能力不及醋酸菌，推測可能是醋酸菌利用乙醇生成的乙酸能輕易穿透乳酸菌的細(xì)胞膜引起細(xì)胞死亡[17]。此外，亓正良等[18]對A.pasteurianus在醋酸發(fā)酵過程中能量代謝的研究發(fā)現(xiàn)，添加琥珀酸和蘋果酸可以提高醋桿菌耐酸能力和醋酸生產(chǎn)能力，強(qiáng)化細(xì)胞產(chǎn)能，從而使菌株在高酸環(huán)境中繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸。山西老陳醋釀造過程中琥珀酸、蘋果酸的生成，可能是醋酸菌耐酸能力強(qiáng)、產(chǎn)酸高的另外一種原因，具體機(jī)理還有待繼續(xù)研究。

本課題組前期的微生物統(tǒng)計結(jié)果表明[19]，成熟酒醪中依然存在大量的乳酸菌和醋酸菌，它們在酒精發(fā)酵階段受高濃度乙醇(體積分?jǐn)?shù)8%～9%)的脅迫，存活但基本不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸很少，經(jīng)過長期的適應(yīng)，對乙醇的耐受能力逐漸提高，可以耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇。分離到的乳酸菌和醋酸菌在高溫(>42 ℃)條件下都能存活，可能與山西老陳醋高溫醋酸發(fā)酵工藝有關(guān)，產(chǎn)酸菌經(jīng)過長期的高溫馴化，對溫度的耐受能力也逐漸增強(qiáng)。有研究表明[20-21]，從食醋醋醅中分離獲得的A.pasteurianus普遍具有高耐受性，可以耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇及43 ℃的高溫，與本試驗的研究結(jié)果一致。液態(tài)食醋和果醋發(fā)酵通常是將純菌種接種至高乙醇含量的發(fā)酵液中，由于同種微生物快速繁殖、集中代謝，勢必會導(dǎo)致發(fā)酵液中積累較高濃度的乙酸，同時釋放大量的熱，這就要求主體發(fā)酵微生物具有較好的環(huán)境耐受性。參與山西老陳醋發(fā)酵的微生物經(jīng)過長期高溫、高酸環(huán)境的馴化，具有較好的耐受性，且致病性較低，因此本研究篩選出來的醋酸菌和乳酸菌在液態(tài)食醋和果醋發(fā)酵方面具有很大的應(yīng)用潛力，可制成菌劑進(jìn)行初試試驗。

4 結(jié)論

采用純培養(yǎng)方式對山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸微生物進(jìn)行了分離純化，共獲得54株產(chǎn)酸菌。對分離得到的22株醋酸菌和32株乳酸菌進(jìn)行了產(chǎn)酸能力測試及環(huán)境耐受性分析，篩選出的醋酸菌經(jīng)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和16S rDNA序列分析法鑒定為巴氏醋桿菌，產(chǎn)酸能力為(35.5±0.48)g/L，能耐受42 ℃高溫、體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇和5.0 g/100mL的乙酸，且遺傳性能較穩(wěn)定；篩選出來的優(yōu)勢乳酸菌經(jīng)鑒定后為戊糖片球菌，其產(chǎn)酸能力為(9.56±0.23)g/L，能耐受50 ℃高溫和體積分?jǐn)?shù)12% 的乙醇。