基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析門氏保元湯治療過敏性紫癜的作用機(jī)制

程生輝，劉逸軒，姚帥君，門九章

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

過敏性紫癜是系統(tǒng)性IgA 免疫復(fù)合物介導(dǎo)的白細(xì)胞破碎性血管炎，臨床特征主要為皮膚非血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)炎、胃腸道出血及腎炎等。發(fā)病機(jī)制為毛細(xì)血管變態(tài)反應(yīng)和血管的自體免疫損傷［1］。門氏保元湯是門九章教授治療過敏性疾病和自身免疫性疾病的常用方主方，由當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草5 味藥組成，以“扶正培元，標(biāo)本兼顧”組方，針對過敏性紫氣陰兩虛、熱瘀互結(jié)的病機(jī)特點(diǎn)，具有清熱解毒、益氣活血等功效，有著良好的臨床效果［2-3］。

整合藥理學(xué)是融合了中藥學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科的交叉學(xué)科，用以研究藥物與機(jī)體的相互作用及作用原理［4］。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺（TCMIP，http：www.tcmip.cn），本研究對門氏保元湯治療過敏性紫癜的機(jī)制進(jìn)行了探究與分析，為闡釋本方分子機(jī)制以及臨床新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分來源

在整合藥理學(xué)平臺（http：//www.tcmip.cn/）中的中藥材數(shù)據(jù)庫，收集中藥材當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、甘草所含有的化學(xué)成分，建立門氏保元湯的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶基因預(yù)測

通過整合藥理學(xué)平臺“整合藥理學(xué)分析工具”采取化學(xué)成分二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，即采用MACCS 分子指紋特征提取方法和Tani-moto 系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法，針對中藥化學(xué)成分和美國食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進(jìn)行相似性打分，從而獲取高可信度（相似度＞0.8）的中藥候選靶點(diǎn)譜，在平臺“中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”版塊分別輸入當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草，即可獲得不同的藥物的化學(xué)成分信息，并可提取不同成分對應(yīng)靶點(diǎn)信息。

整合藥理學(xué)平臺TCMIP 平臺依托“人類表型本體數(shù)據(jù)庫（HPO）”“Drugbank 數(shù)據(jù)庫”“基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）”“治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD）”等資源，構(gòu)建疾病和常見臨床表型相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫。在平臺“疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘”板塊以“allergic purpura”為疾病或癥狀進(jìn)行檢索，提取檢索出來的所有治療靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘與分析

TCMIP 平臺整合了蛋白互作數(shù)據(jù)庫（Database of Interacting Protein，DIP）、分子交互數(shù)據(jù)庫（molecular interaction Database，MINT）人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（Human Protein Reference Database，HPRD）、反應(yīng)途徑數(shù)據(jù)庫（Reactome Pathway Database，Reactome）等8 個(gè)現(xiàn)有的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的信息，通過整合藥理學(xué)平臺的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建門氏保元湯的潛在作用靶點(diǎn)-過敏性紫癜疾病靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過整合藥理學(xué)平臺網(wǎng)絡(luò)分析模塊，計(jì)算靶點(diǎn)之間的PPI 網(wǎng)絡(luò)特征值，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2 倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶點(diǎn)-疾病基因網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)（hubs）；并且在此基礎(chǔ)上，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取滿足3 個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，而后對關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析，選取P 值前20 的通路，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”的多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對其進(jìn)行可視化分析。

TCMIP 基于基因本體數(shù)據(jù)庫（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG），確定藥物靶點(diǎn)所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路。結(jié)合富集計(jì)算，獲得門氏保元湯及其治療過敏性紫癜關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及其所參與的網(wǎng)絡(luò)通路。按P 值大小取前20 個(gè)GO 及KEGG 分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 門氏保元湯的化學(xué)成分分析及靶標(biāo)預(yù)測

門氏保元湯共收集化學(xué)成分301 個(gè)，化合物主要為黃酮類、三萜類和有機(jī)酸類等。當(dāng)歸收集到的成分有66 個(gè)，主要為有機(jī)酸類和揮發(fā)油化合物；元參收集到的成分有30 個(gè)，主要為環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷類化合物；金銀花共收集化學(xué)成分47 個(gè)，主要為有機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油類化合物；黃芪共收集化學(xué)成分27 個(gè)，主要為三萜皂苷類、黃酮類化合物；甘草共收集化學(xué)成分131 個(gè)，主要為三萜類、黃酮類化合物。當(dāng)歸的60 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測出251 個(gè)靶標(biāo)，元參中30 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測出73 個(gè)靶標(biāo)，金銀花中47 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測出133 個(gè)靶標(biāo)，黃芪中27 個(gè)成分共預(yù)測出249 個(gè)靶標(biāo)，甘草中131 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測出184個(gè)靶標(biāo)。

對中藥方劑候選靶標(biāo)進(jìn)行功能分析（表1），可見候選靶標(biāo)基因功能涉及輔因子代謝、四氫葉酸互變、一氧化氮合酶合成、肽基-絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)等條目。對中藥方劑候選靶標(biāo)進(jìn)行通路富集分析（表2），可見涉及通路有四氫蝶呤合成、葉酸和嘌呤代謝、細(xì)胞內(nèi)受體的類泛素化、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等通路。

2.2 門氏保元湯治療過敏性紫癜的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

通過整合藥理學(xué)平臺的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，構(gòu)建了門氏保元湯潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)上述條件共獲得62 個(gè)靶點(diǎn)并篩選出25個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（表5），采用PPI 模塊構(gòu)建了“藥物-疾病核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1），圖中節(jié)點(diǎn)的大小與degree 呈正比。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，門氏保元湯對過敏性紫癜的干預(yù)機(jī)制涉及B 細(xì)胞增殖、一氧化氮生物合成過程、輔因子代謝過程、血小板聚集、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路等多個(gè)條目（表3）。通路富集分析結(jié)果顯示主要集中在NF-κB 信號通路異常導(dǎo)致免疫缺陷、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 的異常轉(zhuǎn)導(dǎo)以及BRAF 對RAF 激酶的異常激活等通路（表4）。

2.3 門氏保元湯治療過敏性紫癜的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

表1 門氏保元湯候選靶點(diǎn)功能信息

表2 門氏保元湯候選靶點(diǎn)參與的通路信息

表3 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點(diǎn)生物過程富集分析

涉及到的通路主要有NF-κB 信號通路、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 編碼RAF 激酶等通路。從候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)與“藥物-化學(xué)成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），認(rèn)為門氏保元湯對過敏性紫癜的干預(yù)作用與血小板代謝、NF-κB 信號通路以及BRAF 編碼RAF 激酶等有關(guān)。

表4 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點(diǎn)通路富集分析

表5 門氏保元湯治療過敏性紫癜關(guān)鍵靶點(diǎn)

3 討論

圖1 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

門氏保元湯由當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草組成，黃芪多糖可以顯著增加胸腺和脾內(nèi)T 細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)IgG 的生成，從而提高機(jī)體的免疫功能；抑制血小板相關(guān)抗體，減少血小板的損傷與破壞［5］。黃芪甲苷、黃芪黃酮等能使血管的通透性得到改善，使毛細(xì)血管對損傷的抵抗力增強(qiáng)，使出血的風(fēng)險(xiǎn)得到降低［6］。當(dāng)歸有機(jī)酸具有抑制抗血小板凝聚的作用，當(dāng)歸多糖具有升高血小板和刺激骨髓造血的功能［7］。元參苯丙素苷能減少血管炎癥，元參環(huán)烯醚萜苷能有效抑制血小板聚集［8］。金銀花有機(jī)酸類化合物有抗血小板凝聚和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷的作用［9］。甘草中的甘草皂苷和甘草黃酮類能抑制致炎性因子，有明顯的抗變態(tài)反應(yīng)作用［10］。

圖2 門氏保元湯治療過敏性紫癜“中藥-成分-核心靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

經(jīng)過富集分析得出，門氏保元湯治療過敏性紫癜與NF-κB 信號通路、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、血小板代謝以及BRAF 編碼RAF 激酶有著密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 是一種由兩個(gè)亞單位（P50 和P65）組成的二聚體［11］。由于NF-κB 參與多種蛋白基因轉(zhuǎn)錄，且與T 細(xì)胞的活化密切相關(guān)［12］。T 細(xì)胞過度激活是過敏性紫癜發(fā)病的機(jī)制之一，有研究認(rèn)為黃芪能抑制NF-κB 的活性，從而減少T 細(xì)胞的過度活化［13］。NO 是具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子，可調(diào)節(jié)血管張力及血流速度，防止血小板黏附和血栓形成［14］。研究表明，黃芪多糖能激活被抑制的AMPK-eNOS 通路，進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［15］。當(dāng)歸能夠?qū)ρ“寰奂a(chǎn)生明顯的抑制作用，也可以提高已聚集血小板的解聚率［16］，從而對過敏性紫癜起到一定的治療作用。血小板膜糖蛋白（ITGA2B）是一類與血小板凝聚有關(guān)的蛋白，這類蛋白主要參與出血與凝血過程，并發(fā)揮著重要的作用。對于HSP 患兒來說，其自身的血小板聚集功能加強(qiáng)，因而存在血液的高凝狀態(tài)甚至?xí)纬晌⒀?。ITGA2B 含量的增加是導(dǎo)致血小板凝聚、微血栓形成的關(guān)鍵原因［17］。而當(dāng)歸有機(jī)酸、金銀花有機(jī)酸、元參環(huán)烯醚萜苷有抗血小板凝聚的作用，能降低細(xì)胞內(nèi)ITGA2B 的水平，從而對過敏性紫癜起到治療作用。有研究報(bào)道，BRAF 基因編碼RAF 家族蛋白激酶，該蛋白在調(diào)節(jié)MAPK-ErK 信號通路中起重要作用，影響細(xì)胞分裂，分化和分泌；并且影響著腫瘤的產(chǎn)生及進(jìn)展，有著生長、增殖甚至是凋亡細(xì)胞的作用［18-19］。有研究發(fā)現(xiàn)可通過活化MAPK/Erk 信號通路，對糖尿病血管病變中起到抑制作用［20］，另有研究發(fā)現(xiàn)白芷提取物可能通過增加NO 和TNF-α 產(chǎn)物，激活MAPK 通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制大腸癌瘤體的增長［21］。潘耀謙等［22］研究發(fā)現(xiàn)Erk 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過強(qiáng)大的級聯(lián)反應(yīng)參與了家兔腦炎原蟲性腦肉芽腫的形成，在腦肉芽腫形成過程中促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究借助整合藥理學(xué)這一新興學(xué)科理念及技術(shù)，對門氏保元湯治療過敏性紫癜的作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，既為該方未來的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，也為過敏性紫癜的臨床治療提供更加開闊的思路。