基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 快速鑒定桂枝中水溶性成分

劉 瑞，泰 剛，王 瑞，張淑蓉

（1.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；2.山西省食品藥品檢驗所，山西 太原 030001）

桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥嫩枝［1］，味辛、甘，性溫，具有發(fā)汗解肌、溫通經脈、助化陽氣、平沖降氣等功效，在臨床上多用于風寒感冒、脘腹冷痛、血寒經閉、關節(jié)痹痛、痰飲、水腫、心悸、奔豚等［2-3］。桂枝臨床應用廣泛，常與白術、麻黃、桃仁、芍藥和附子等配伍，其中用于治療風寒表虛證的桂枝湯因其組方嚴謹，力效專宏而被譽為張仲景“群方之冠”。

目前桂枝的研究主要集中在桂枝中肉桂酸、肉桂醛等簡單苯丙素類成分的研究及藥理作用方面，對桂枝中黃酮、木脂素和苷類等其他化學成分研究較少［4-5］。臨床應用中，桂枝多以湯劑形式用藥，湯劑中所含成分復雜，且主要為水溶性成分，因此本文采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道肼高分辨質譜技術（ultrahigh performanceliquid chromatography-quadrupole/orbitrapmass spectrometry，UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）對桂枝水提液的化學成分進行研究。通過高分辨質譜數據解析，并結合對照品對照、質譜裂解規(guī)律和相關文獻檢索等共鑒定出20 個水溶性化合物，為進一步深入闡明桂枝的藥效物質基礎、配伍機制及臨床應用等相關研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000 二元超高壓液相色譜系統(tǒng)，Thermo Scientific Q-Exactive Focus 質譜儀，電噴霧離子源，Xcalibur 工作站（美國Thermo Scientific 公司），BT25 電子分析天平（德國Sartorius）。

桂枝購自山西省太原市同仁堂大藥房（產地廣西），經山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院裴香萍副教授鑒定為樟科植物桂枝的干燥嫩枝。肉桂酸（批號：180824），購買于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%。乙腈（色譜純，美國賽默飛公司），甲酸（色譜純，天津科密歐試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與質譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm ID，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序為：0～13 min，5%B～15%B；13～17 min，15%B；17～25 min，15%B～85%B；25～30 min，85%B。柱溫30 ℃，進樣量2 μL，流速0.2 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源，鞘氣和輔助氣為高純氮氣，碰撞氣體為高純氦氣，噴霧電壓正離子模式下為3.5 kV，負離子模式下為2.5 kV，離子傳輸管溫度300 ℃，輔助氣加熱溫度320 ℃，射頻透鏡電壓50 V。質量掃描范圍為m/z 100～1500，正負離子切換掃描，一級質譜全掃描結合數據依賴性二級質譜掃描，分辨率：MS1-70 000 FWHM，MS2-17 500 FWHM，高能量碰撞解離（HCD）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取桂枝9 g 置于圓底燒瓶中，加入10 倍量的水浸泡30 min，回流提取1 h，過濾；殘渣再加入10 倍量的水回流提取1 h，過濾。合并2 次濾液，加熱濃縮至9 mL（約含生藥1 g/mL）。取溶液1 mL，加50%甲醇溶液10 mL 稀釋后，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取肉桂酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇水制成濃度10 μg/mL的溶液，備用。

2.3 桂枝中水溶性成分解析

桂枝水提液在“2.1 項”色譜和質譜條件下得到的總離子流圖，見圖1。根據Q-Orbitrap 高分辨質譜的一級質譜中化合物的準分子離子、加和離子等信息推測精確分子量，Xcalibar 4.0 軟件在5 ppm質量偏差范圍內擬合其分子式；再根據二級質譜中碎片離子、裂解規(guī)律以及與對照品、參考文獻、PubChem、massbank 等數據庫比對等方式對化學成分的推導鑒定和確證。最終，從桂枝水提液中鑒定了20 個化學成分，其中部分化學成分的結構式見圖2，鑒定結果見表1。

化合物2 準分子離子峰m/z 153.018 1［M-H］-，Xcalibar 軟件擬合并推測其最可能的分子式為C7H6O4，二級質譜中生成m/z 109.03［M-H-CO2］-，結合文獻［6］鑒定化合物2 為原兒茶酸?；衔?準分子離子峰m/z 315.072 6［M-H］-，推測其最可能的分子式為C13H16O9，二級質譜中失去1 分子六碳糖C6H10O5（162 Da）生成碎片離子m/z 153.02，并繼續(xù)失去1 分子CO2生成m/z 109.03，因此推測化合物1 為原兒茶酸葡萄糖苷。

圖1 桂枝總離子流圖（A：負離子模式；B：正離子模式）

圖2 桂枝中部分化學成分的結構式

圖3 肉桂醇苷裂解規(guī)律

表1 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS 鑒定桂枝的化學成分

化合物3 準分子離子峰為137.023 1［M-H］-，推測其分子式為C7H6O3。二級質譜中形成碎片離子m/z 119.02［M-H-H2O］-，m/z 109.02［M-H-CO］-，根據文獻［7］和MassBank 數據庫，推測其為對羥基苯甲酸。

化合物4 和5 的保留時間分別為8.81 和10.90 min，在負離子模式下準分子離子峰均為m/z 289.072 2［M-H］-，正離子模式下準分子離子峰均為m/z 291.086 5［M+H］+，故確定化合物的分子量為290，軟件擬合其分子式為C15H14O6。兩個化合物的二級質譜碎片離子相同，均形成m/z 245［M-H-CO2］-，且形成m/z 125.02 1，4A-，1，3A m/z 137.02-，1，2Am/z 165.02 和［M-H-B 環(huán)］-m/z 179.03 等4 個兒茶素類化合物的特征性離子［8］，故推測化合物4 和5分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物6 的保留時間為11.44 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z 327.108 6［M-H］-，655.225 0［2M-H］-，確定其分子量為328，軟件擬合其分子式為C15H20O8。二級質譜中生成m/z 165.05［M-H-Glu］-，m/z 121.06［M-H-Glu-CO2］-，根據其裂解規(guī)律和文獻［9］推測其為二氫肉桂苷。

化合物7 和16 二者準分子離子峰均為m/z 165.054 79［M+H］＋，二級質譜中失去1 分子H2O生成m/z 147.04 碎片，繼續(xù)丟失1 分子CO 生成m/z 119.04，丟失1 分子CO 生成m/z 91.05 碎片，且比肉桂酸分子量多16，故推斷化合物6 和17為羥基肉桂酸及其異構體。桂枝中含有較多的肉桂酸、羥基肉桂酸等具有C6～C3結構的苯丙素類化合物及其衍生物，其二級質譜中易脫去H2O、CO、CO2等小分子產生相應的碎片離子峰。

化合物8 和9 互為同分異構體，二者準分子離子峰為m/z 581.224 7［M-H]-，m/z 627.230 1［MH+COOH]-，確定相對分子量為582，軟件擬合其分子式為C28H38O13。二級質譜中脫去1 分子葡萄糖（162 Da）生成苷元離子m/z 419.171 4。繼而生成m/z 404.15［M-H-CH3］-，m/z 401.16［M-H-H2O］-，m/z 389.12［M-H-2CH3］-，m/z 373.13［M-H-H2O-CO］-，m/z 359.11［M-H-4CH3］-等碎片離子，根據以上數據并參考文獻［10-11］將其指認為（+）南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷和（-）-4-epi-南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物10 的保留時間為14.52 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z 303.051 36［M-H］-，擬合其分子式為C15H12O7。其二級質譜圖中生成m/z 285.04［M-H-H2O］-、m/z 275.05[M-H-CO］，m/z 259［M-H-CO2］-，m/z 241［M-H-CO2-H2O］-和C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解生成m/z 125（A1，4-）等碎片離子。通過查閱文獻［12］，該化合物的質譜裂解規(guī)律符合二氫槲皮素的結構特點，因此鑒定化合物10 為二氫槲皮素。

化合物11 的保留時間為14.76 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z 427.161 2［M-H］-，m/z 473.166 8［M-H+HCOOH］-，軟件擬合其分子式為C20H28O10。根據其裂解規(guī)律推測為肉桂醇苷（絡塞維），二級質譜中m/z 293.08 為母離子失去1 分子肉桂醇生成，m/z 133.06 為母離子失去結構中的阿拉伯糖和葡萄糖形成的苷元肉桂醇，裂解規(guī)律見圖3。另可見阿拉伯糖（Ara）碎片離子131.03［Ara-HH2O］-、113.02［Ara-H-2H2O］-和葡萄糖（Glu）碎片離子161.04［Glu-H-H2O］-、143.03［Glu-H-H2OH2O］-、131.03［Glu-H2O-CH2O-H］-、119.03［Glu-H2O-C2H2O-H］-和113.02［Glu-H2O-CH2O-H2O-H］-。

化合物13 負離子模式下準分子離子峰為m/z 429.177 3［M-H］-，其分子式為C20H30O10，比化合物11 分子量多2 Da，其二級質譜中生成297.13［M-H-Ara］-，同時也生成阿拉伯糖（Ara）和葡萄糖（Glu）碎片離子相應的碎片離子。絡塞維苷元肉桂醇結構中含有一個雙鍵，故推斷化合物13 為二氫絡塞維?；衔?2 和14 分別為絡塞維和二氫絡塞維的順反異構體。

化合物18 保留時間為20.30 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z 147.043 91［M-H］-，二級質譜裂解形成m/z 131.05［M+H-CO］-、m/z 103.05［M+H-CO2］-；正離子模式下準分子離子峰為m/z 149.059 9［M+H］＋，二級質譜裂解形成m/z 131.05［M+H-H2O］+、m/z 103.05［M+H-H2O-CO］＋的碎片離子，其質譜裂解規(guī)律和文獻中肉桂酸相同［13］，并進一步通過與對照品比對，確認化合物18 為肉桂酸。

化合物15、17 和19 依此規(guī)律分別鑒定為甲氧基肉桂酸、香豆素和甲基肉桂酸。

化合物20 的保留時間為24.15 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z 295.097 6［M-H］-，推測其最可能的分子式為C28H38O13。二級質譜中脫去1 分子H2O 生成碎片離子m/z 277.09，繼而丟失1 分子CO2生成碎片離子m/z 233.10，根據其質譜裂解規(guī)律，并參照文獻［14］暫定化合物20 為（3-methoxy-5H-9，11-dioxabenzo［3，4］-cyclohepta-［1，2-f］-iden-7-yl）metahnol。

3 討論

中藥為公認的復雜體系，其整體藥效表征具有多成分、弱效應、協調整合作用等特點。繁雜多樣的化學成分是中藥及其方劑發(fā)揮多種藥理活性的物質基礎。隨著現代儀器分析技術的快速發(fā)展，液質聯用技術把色譜的高分離性能和質譜的高選擇性、高靈敏度及碎片離子重現性好的優(yōu)點結合起來［15］，已被廣泛用于中藥及其制劑的研究，極大地推動了中藥現代化的發(fā)展。

本研究采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道肼高分辨質譜對桂枝藥材水煎液的成分進行了較為全面的分析，基于化合物的精確分子量、裂解特征、相關數據庫和參考文獻，鑒定了桂枝藥材水煎液中20 種化合物，包括苯丙素、苯丙素苷、木脂素、黃酮、倍半萜和小分子有機酸等多種類型的化合物，研究結果為進一步闡明桂枝及其方劑的藥效物質及作用機制提供了科學的依據。