基于綠色熒光蛋白的冷鮮豬肉中大腸桿菌預(yù)測模型的構(gòu)建

劉變芳，胡輝帆，張義奎，蔡 錦，杜雙奎，李俊麗，曹夢茜，呂 欣

基于綠色熒光蛋白的冷鮮豬肉中大腸桿菌預(yù)測模型的構(gòu)建

劉變芳，胡輝帆，張義奎，蔡 錦，杜雙奎，李俊麗，曹夢茜，呂 欣※

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，楊凌 712100）

為了預(yù)測和監(jiān)控冷鮮豬肉儲存過程中腐敗細菌大腸桿菌的變化規(guī)律，評估產(chǎn)品貨架期，建立微生物生長預(yù)測模型。該研究將綠色熒光蛋白質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，構(gòu)建GFP的標(biāo)記大腸桿菌。基于綠色熒光蛋白報告基因和氨芐青霉素抗性，采用稀釋平板法定量追蹤檢測0～24 ℃條件下冷鮮豬肉中DH5α生長變化。采用Gompertz模型、平方根模型和響應(yīng)面方程進行數(shù)據(jù)擬合，構(gòu)建數(shù)學(xué)預(yù)測模型。結(jié)果表明Gompertz模型擬合效果良好，0～20 ℃條件下決定系數(shù)2為0.96～0.99。溫度與最大比生長速率平方根、延遲期倒數(shù)平方根模型2分別為0.862、0.948。響應(yīng)面模型揭示時間、溫度對大腸桿菌的生長影響顯著(<0.05)，二者交互作用明顯，響應(yīng)面模型2為0.815。模型能夠有效擬合冷鮮豬肉中與溫度、時間相關(guān)的大腸桿菌的生長變化規(guī)律，研究結(jié)果為產(chǎn)品儲存過程中細菌變化預(yù)測提供理論依據(jù)。

溫度；模型；冷鮮豬肉；大腸桿菌DH5α；追蹤檢測；Gompertz預(yù)測模型

0 引 言

近年來，冷鮮豬肉已逐步成為各大城市肉品消費的主流，而隨著生活水平的不斷提高，人們對其質(zhì)量與安全問題越來越關(guān)注[1]。冷鮮豬肉營養(yǎng)豐富，含水率高，極易受微生物污染，特別是在生產(chǎn)、加工、銷售過程如果冷鏈系統(tǒng)不完善，溫度條件控制不當(dāng)，微生物就會迅速增殖，加速肉的腐敗變質(zhì)，最終對公共健康構(gòu)成潛在的威脅[2-3]。大腸桿菌來源于人和動物的腸道，廣泛存在水、土壤、空氣等生活環(huán)境中，是冷鮮豬肉中的一類主要腐敗菌，也是食品必須檢測的細菌指標(biāo)。新鮮和冷凍的豬肉、牛肉以及相關(guān)的肉制品中，普遍存在腸桿菌科微生物。一些腸道致病菌如沙門氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)毒素大腸桿菌等和普通大腸桿菌來源和在環(huán)境中生長條件基本一致，食品中的大腸桿菌污染指標(biāo)也是這些腸道致病菌污染情況的一個間接指示[4-5]。因此，追蹤檢測并預(yù)測冷鮮豬肉生產(chǎn)、貯存和流通過程中的大腸桿菌的污染及生長變化規(guī)律，對預(yù)測鮮肉保質(zhì)期，提高肉品質(zhì)量和保障安全具有非常重要的實踐意義[6]。

預(yù)測微生物學(xué)是運用微生物學(xué)、工程數(shù)學(xué)以及統(tǒng)計學(xué)對食品微生物進行數(shù)學(xué)建模，從而對微生物在食品加工、貯藏、流通等條件下的延遲、生長、殘存和死亡進行定量分析[7-8]。預(yù)測食品中微生物的動態(tài)變化不僅可以對食品安全作出快速評估和預(yù)測，而且可用于食品貨架期預(yù)測[9]。Gompertz模型是用來描述生物種群生長發(fā)育規(guī)律的數(shù)學(xué)模型，該模型最先是由英國數(shù)學(xué)家Benjamin Gompertz于1825年提出作為動物種群生長模型，用于描述種群的消亡規(guī)律[10-12]。模型在應(yīng)用特點上適合那些S型曲線、病情發(fā)展先快后慢的病害曲線擬合。已被廣泛用于食品微生物生長預(yù)測領(lǐng)域的Gompertz模型能夠較好地用于描述單細胞微生物的典型生長曲線，分別用延遲期、最大比生長速率、最大菌落數(shù)來描述細菌生長的延遲期、指數(shù)期和穩(wěn)定期的特征[13]。綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因是可以在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，不需要反應(yīng)底物及其他輔助因子，無種屬組織特異性，且產(chǎn)物GFP對細胞無毒性，檢測簡單，結(jié)果真實可靠的新型報告基因。近年來GFP報告基因廣泛應(yīng)用于腸道細菌的快速標(biāo)記檢測研究中[14-16]。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2016[17]規(guī)定食品的細菌總數(shù)檢測采用稀釋平板法，大腸菌群檢測采用MPN值測定方法，這些方法要求對產(chǎn)品隨機抽樣檢測，檢測程序中微生物需要經(jīng)歷多次培養(yǎng)，方法不僅費時費力，而且較難及時反映總體消費的安全性。預(yù)測微生物學(xué)的優(yōu)勢則在于利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)去預(yù)測未來發(fā)展趨勢，對實際生產(chǎn)和流通過程進行微生物預(yù)測和監(jiān)控，保證產(chǎn)品的安全性。本研究將綠色熒光蛋白質(zhì)粒（Plasmid of Green Fluorescent Protein, pGFP）標(biāo)記的大腸桿菌（DH5α）定量轉(zhuǎn)接到冷鮮豬肉介質(zhì)中，追蹤檢測不同溫度條件下大腸桿菌的生長變化規(guī)律，構(gòu)建數(shù)學(xué)預(yù)測模型，為快速監(jiān)控和預(yù)測冷鮮豬肉產(chǎn)品中微生物的污染情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

大腸桿菌DH5a，綠色熒光蛋白質(zhì)粒pGFP（含有氨芐青霉素Amp抗性基因），均由本實驗室保存。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，1 000 mL蒸餾水。配置后調(diào)整pH值至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。試驗所用4 ℃鮮豬肉購自超市，選取前腿肉，用絞肉機絞碎。主要試劑：乙醇，氯化鈉，葡萄糖，硫酸等均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氨芐青霉素，胰蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉等均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

倒置熒光顯微鏡CFM-500、手提式紫外分析儀WFH-203、日立紫外-可見光分光光度計3900H（上海長方光學(xué)儀器有限公司）；冷凍離心機TDL-36C（上海精密儀器有限公司）；精裝絞肉機SZ-32（廣州旭眾食品機械有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3020CH（上海申安醫(yī)療器械廠）；潔凈工作臺SW-CJ-ZFD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；智能生化培養(yǎng)箱HWS（寧波江南儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建GFP標(biāo)記大腸桿菌DH5α

制備DH5α感受態(tài)細胞，從37 ℃過夜培養(yǎng)LB平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到100 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至吸光度OD600值為0.45。培養(yǎng)物移至聚丙烯離心管中，冰上放置10 min，4 ℃，4 200×離心10 min收集細胞。10 mL，0.1 mol/L 的預(yù)冰冷的CaCl2重懸細胞沉淀，冰浴。重復(fù)1次低溫離心，2 mL 0.1 mol/L 預(yù)冷CaCl2懸浮，分裝，?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

pGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株。取新鮮DH5α感受態(tài)細胞200L，置于1.5L離心管中，加入pGFP質(zhì)粒2L，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置30 min。42 ℃水浴鍋熱激90 s，加入LB培養(yǎng)液800L，37 ℃搖床培養(yǎng)45 min后，涂布接種到在含80g/mL 氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。第二天，篩選抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化子并用倒置熒光顯微鏡檢測GFP表達，將穩(wěn)定表達GFP的單菌落劃線轉(zhuǎn)接抗性平板純化擴增后，用含體積分?jǐn)?shù)16%甘油的LB培養(yǎng)液重懸，于?80 ℃冷凍保藏，備用[18-19]。

1.2.2 GFP標(biāo)記大腸桿菌DH5α生長曲線測定

將?80 ℃冷凍保藏穩(wěn)定表達GFP的大腸桿菌DH5α劃線接種氨芐青霉素抗性平板活化，37 ℃過夜培養(yǎng)。第2天挑取單菌落轉(zhuǎn)接到含5 mL LB培養(yǎng)液試管中，搖床培養(yǎng)至OD600值為0.45，按體積分?jǐn)?shù)1%接種比例轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床培養(yǎng)，分別在0、1.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0和24.0 h取2 mL菌液測定OD600值，并以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制細菌生長曲線[20]。大腸桿菌DH5α用LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，作為對照菌株測定其生長曲線。

1.2.3 冷鮮豬肉樣品處理及GFP標(biāo)記大腸桿菌DH5α的測定

參考中國現(xiàn)行分割鮮、凍豬瘦肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9959.2-2008[21]中規(guī)定的微生物指標(biāo)，菌落總數(shù)≤1×106CFU/g，大腸菌群≤1×104MPN/100 g，沙門氏菌不得檢出。本試驗對購自超市的冷鮮豬肉細菌總數(shù)和大腸菌群進行檢測，選擇符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的冷鮮豬肉作為本試驗研究材料。取500 g冷鮮豬肉用絞肉機絞碎，用無菌注射器定量接種GFP標(biāo)記大腸桿菌DH5α菌液，混勻。測定菌液的OD600值，按照菌液OD600值等于1時細胞濃度約為108個/mL，根據(jù)實測菌液的OD600值按比例計算500 g豬肉樣品中需要接種的菌液量，控制接種初始濃度為102個/100 g。比如測定菌液OD600值為0.2，則其細胞濃度為2×107個/mL，稀釋1 000倍后細胞濃度為2×104個/mL，按比例計算500 g豬肉樣品中應(yīng)添加25L1 000倍稀釋的菌液，則豬肉樣品中細胞濃度為102個/100 g。對照組冷鮮豬肉樣品絞碎但不接種細菌。樣品放入錫箔紙杯并用保鮮膜封蓋，放置托盤上分別放入0、4、8 ℃冰箱，12、16、20和24 ℃的生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時取樣檢測大腸桿菌DH5α菌數(shù)。

冷鮮豬肉中大腸桿菌DH5α的測定，采用氨芐青霉素抗性LB平板稀釋傾注法結(jié)合手提式紫外分析儀檢測。0 ℃每24 h取樣測定，4、8和12 ℃每12 h取樣測定，16、20和24 ℃每8 h取樣進行測定。稱取樣品25 g放入含225 mL無菌生理鹽水三角瓶中，震蕩混勻，進行10倍系列稀釋。取稀釋樣品1 mL接種到無菌平皿，然后平皿中傾注含80g/mL 氨芐青霉素、50 ℃得營養(yǎng)瓊脂，混勻冷卻凝固后37 ℃培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)，并在手提式紫外分析儀下檢測帶綠色熒光菌落。選擇3個連續(xù)的稀釋度樣品，每個稀釋度做3個平行，無菌水做為陰性對照。

1.2.4 Gompertz初級模型的建立

Gompertz初級模型描述不同溫度下大腸桿菌培養(yǎng)時間與細菌數(shù)量的關(guān)系，模型的決定系數(shù)2描述了試驗擬合參數(shù)的相關(guān)性，2越接近1表明擬合度越高，參數(shù)之間的相關(guān)性越強[22]。采用1stOpt1.5軟件進行數(shù)據(jù)模擬，過程優(yōu)化算法選擇麥夸特法（Levenberg-Marquardt)加通用全局優(yōu)化法，結(jié)合模型均方根誤差（Root Mean Squared Error，RMSE)、殘差平方和（Residual Sum of Squares，RSS)判定模型適用性。

Gompertz方程式是雙指數(shù)函數(shù)表達式為：

式中l(wèi)g為細菌在時間時菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/100 g）；是隨時間無限減小時漸進菌數(shù)對數(shù)，（即初始菌落總數(shù)對數(shù)lg0）；是隨時間增加菌數(shù)增量的對數(shù)，lg(max/0)；是時間為時相對最大比生長速率，h-1；為達到相對最大比生長速率所需時間，h。公式中、和為模型參數(shù)，由Gompertz方程擬合得出，為初始菌數(shù)對數(shù)值由試驗檢測得出。根據(jù)不同溫度條件下的大腸桿菌檢測數(shù)據(jù)，由Gompertz方程擬合得出、和參數(shù)，進而由公式推算大腸桿菌相關(guān)生長規(guī)律數(shù)據(jù)參數(shù)，包括延遲期（Lag Phase Duration，LPD）、最大比生長速率（max）和最大細胞濃度（Maximum Population Density，MPD）。其中最大比生長速率max=·/，=2.718 2；延遲期LPD=?(1/)；最大細胞濃度MPD=+。

1.2.5 平方根二級模型的建立

二級模型研究溫度對于一級模型參數(shù)的影響，采用平方根模型擬合溫度與最大比生長速率（max）平方根，以及溫度與延遲期（LPD）倒數(shù)的平方根之間的關(guān)系[23]。利用初級模型計算最大比生長速率（max）和延遲期（LPD），平方根模型表達式如下：

式中是培養(yǎng)溫度，℃；min是微生物沒有代謝活動時的溫度，℃，即在此溫度下最大比生長速率為0；lag和k分別為2個方程的系數(shù)。

1.2.6 響應(yīng)面模型的建立

試驗數(shù)據(jù)采用Statistica 8.0軟件擬合分析，對大腸桿菌在不同溫度、時間下的生長規(guī)律建立雙因素響應(yīng)面二級模型。

1.2.7 預(yù)測模型的驗證

不同溫度試驗條件下檢測的大腸桿菌實際菌數(shù)值與模型預(yù)測值進行比較，使用數(shù)學(xué)檢驗參數(shù)偏差值（Bias factor，B）和準(zhǔn)確值（Accuracy factor，A）判定模型的可接受性和準(zhǔn)確性[24]。偏差值B是用來檢查預(yù)測值上下波動的幅度，準(zhǔn)確值A是用來衡量預(yù)測值和實測值之間的差異。當(dāng)計算得到的B和A數(shù)值為1.0，表示預(yù)測值沒有誤差，數(shù)值1.1和0.9分別表示預(yù)測值的上下誤差各為10%。B和A的計算公式如下：

式中l(wèi)gpre是大腸桿菌生長數(shù)學(xué)模型預(yù)測得到的菌數(shù)對數(shù)lg(CFU/100 g)；lgobs是實際測得的大腸桿菌菌數(shù)對數(shù)lg(CFU/100 g)；是試驗次數(shù)。

Gompertz初級模型的驗證試驗分別在0、4、8、12、16、20和24 ℃培養(yǎng)條件下，不同時間點共10次取樣對大腸桿菌數(shù)進行檢測和預(yù)測。響應(yīng)面方程的驗證試驗在4、10、18 ℃培養(yǎng)條件下，分別在培養(yǎng)6、12、24 h共3次取樣對細菌數(shù)進行檢測和預(yù)測。依據(jù)公式（4）和（5）分別計算偏差值B和準(zhǔn)確值A，評價模型的可靠性。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)分別采用軟件1stOpt 1.5和Statistica 8.0進行分析，建立Gompertz模型、平方根模型和響應(yīng)面方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH5α大腸桿菌GFP標(biāo)記檢測及其生長曲線測定

通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法構(gòu)建表達綠色熒光蛋白GFP的大腸桿菌DH5α。劃線轉(zhuǎn)接傳代轉(zhuǎn)化子3次于含氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，第二天用手提式紫外分析儀檢測平板上的熒光綠色菌落，同時挑取單菌落涂于載玻片上，用倒置熒光顯微鏡檢測穩(wěn)定表達GFP的大腸桿菌DH5α，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果揭示傳代過程中構(gòu)建的大腸桿菌可以穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，同時具備氨芐青霉素抗性。在含80g/mL 氨芐青霉素的LB平板上手提式紫外分析儀檢測到表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌菌落，同時在倒置熒光顯微鏡下觀測到表達GFP的大腸桿菌DH5α，說明GFP作為報告基因和氨芐青霉素抗性作為篩選標(biāo)記可以實現(xiàn)對大腸桿菌DH5α的追蹤檢測。

圖2生長曲線測定結(jié)果表明GFP標(biāo)記大腸桿菌DH5α培養(yǎng)過程呈現(xiàn)典型細菌的S型生長曲線，與對照菌株DH5α的生長趨勢基本一致。0～2 h為遲緩期，2～10 h為對數(shù)生長期，10～16 h為穩(wěn)定期，16 h以后進入衰亡期，符合一般細菌動力學(xué)生長規(guī)律。

2.2 冷鮮豬肉中大腸桿菌生長Gompertz預(yù)測模型的建立

GFP標(biāo)記菌株DH5α定量接種冷鮮肉后，不同溫度條件下定時取樣，基于GFP標(biāo)記和Amp抗性用稀釋平板計數(shù)法進行追蹤檢測計數(shù)。試驗數(shù)據(jù)采用1stOpt1.5軟件擬合得到Gompertz一級模型曲線和參數(shù)值（見圖3和表1）。

由圖3可見在冷鮮豬肉中0℃條件下大腸桿菌生長非常緩慢，靜置48h（2 d）后大腸桿菌數(shù)緩慢上升，0 ℃保持192 h（8 d左右）大腸桿菌菌落總數(shù)最大值為6.56 lg(CFU/100 g)。4和8℃條件下大腸桿菌生長緩慢，靜置24h后大腸桿菌菌落總數(shù)明顯上升，72h進入細菌生長穩(wěn)定期，大腸桿菌菌落總數(shù)最大值分別為6.32和7.09 lg(CFU/100 g)。12、16、20和24℃條件下隨著溫度升高，細菌生長速度顯著加快，延遲期明顯縮短，并和溫度呈正相關(guān)，接種后細菌很快進入對數(shù)期，最大值分別為7.47、6.97、7.53和10.04 lg(CFU/100 g)。

表1 冷鮮豬肉中大腸桿菌Gompertz初級模型參數(shù)

注：：菌落總數(shù)初始值，lg（CFU·100 g-1）；：隨時間變化菌數(shù)增加量的對數(shù)值，lg (max·0-1)；：相對最大比生長速率，h-1；：達到相對最大比生長速率所需時間，h；max：最大比生長速率，h-1；MPD：最大細胞濃度，lg（CFU·100 g-1）；LPD：延遲期，h；2：模型決定系數(shù)；RMSE：均方根誤差，lg（CFU·100 g-1）；RSS：殘差平方和。

Note:: Initial total number of bacterial colony, lg (CFU·100g-1);: The logarithm value of the increase in the number of bacteria over time, lg (max·0-1);: Relative maximum specific growth rate, h-1;: The time required to reach the maximum relative specific growth rate, h;max: The maximum specific growth rate, h-1; MPD: Maximum population density lg (CFU·100 g-1); LPD: Lag phase duration, h;2: Determination coefficient of model; RMSE: Root mean square error，lg（CFU·100 g-1）; RSS: Residual sum of squares.

由表1可知，定量接種后冷鮮豬肉樣品中的初始大腸桿菌菌落總數(shù)為2.40～3.25 lg(CFU/100 g)。隨著溫度的升高，相對最大比生長速率和最大比生長速率max增大，延遲期LPD減小，表明溫度是影響大腸桿菌在豬肉中增殖的關(guān)鍵因素之一。0～8℃時豬肉中大腸桿菌生長非常緩慢，延遲期LPD大于40h。16～24℃時大腸桿菌生長延遲期LPD為7~8h。冷鮮豬肉中大腸桿菌Gompertz預(yù)測模型24℃決定系數(shù)2為0.79，0～20 ℃時2為0.96～0.99，擬合效果良好。

2.3 冷鮮豬肉中大腸桿菌平方根二級模型

基于一級預(yù)測模型參數(shù)擬合溫度與最大比生長速率（max）平方根，以及溫度與延遲期（LPD）倒數(shù)的平方根之間關(guān)系的平方根二級預(yù)測模型，如圖4所示。

二級預(yù)測模型大腸桿菌生長溫度和最大比生長速率的平方根模型、生長溫度與遲滯期倒數(shù)的平方根模型擬合效果良好，其決定系數(shù)2分別為0.862和0.948。

2.4 冷鮮肉豬中大腸桿菌生長與溫度、時間的響應(yīng)面模型

溫度和時間是影響冷鮮豬肉中大腸桿菌變化的2個主要因素，采用Statistica 8.0軟件進行雙因素響應(yīng)面模型擬合，結(jié)果如圖5所示。

響應(yīng)曲面模型揭示溫度和時間2個因素對大腸桿菌的生長均有明顯影響，隨溫度升高和時間延長，冷鮮豬肉中大腸桿菌菌數(shù)增多。模型揭示溫度和時間二者交互作用明顯（<0.05)。在0～24℃范圍內(nèi)隨著溫度升高響應(yīng)曲面升高，且隨時間趨于平緩趨勢加快，表明大腸桿菌進入生長穩(wěn)定期時間縮短。響應(yīng)面模型決定系數(shù)2為0.815，調(diào)整決定系數(shù)2adj為0.801。

大腸桿菌響應(yīng)面模型的擬合方程為：

lg=1.740 6+0.073 1+0.054 9+0.003 62+

0.000 2?0.000 22(6)

式中代表溫度，℃；代表時間，h。

2.5 模型有效性的驗證

偏差值B表示模型的結(jié)構(gòu)偏差，即低估預(yù)測或高估預(yù)測的程度。偏差值常結(jié)合準(zhǔn)確值A來對模型進行數(shù)學(xué)檢驗。A值等于1表示預(yù)測值與觀測值之間完全吻合。模型驗證試驗偏差值與準(zhǔn)確值統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 模型的偏差值與準(zhǔn)確值

注：Gompertz模型試驗次數(shù)為10；響應(yīng)曲面模型試驗次數(shù)為3。

Note: The Gompertz model was tested 10 times ; The response surface model was tested 3 times.

由表2可知，Gompertz預(yù)測模型有效性驗證中，0.999<B<1.012，模型偏差小擬合度良好，A值均在1附近波動不大，揭示模型具有一定準(zhǔn)確性。響應(yīng)面模型驗證中1.002<B<1.021，A值均接近1波動不大，模型擬合效果良好。

3 討 論

微生物生長預(yù)測模型中Gompertz 模型能夠較好地模擬微生物生長情況，被廣泛用于食品中微生物的生長模擬研究。董慶利等[25]研究揭示在0～35 ℃條件下Gompertz模型對豬肉中氣單胞菌的生長曲線擬合很好，模型決定系數(shù)2均大于0.99，本研究建立的Gompertz模型能夠很好預(yù)測大腸桿菌在冷鮮豬肉中的生長變化，模型決定系數(shù)2為0.96～0.99，偏差值和準(zhǔn)確值均接近1，模型擬合度良好。本研究揭示豬肉冷藏溫度低于8 ℃時，大腸桿菌生長非常緩慢，大腸桿菌的生長受到溫度因素的明顯抑制，這個結(jié)果與Tang等[26]對冷卻豬肉貨架期預(yù)測研究中腐敗微生物生長的研究結(jié)論基本一致，均表明低溫條件下豬肉中一些腐敗微生物和致病微生物的生長收到明顯抑制，隨著溫度的升高細菌延遲期縮短，生長速率加快。

食品微生物預(yù)測模型研究大多是在細菌培養(yǎng)基中試驗建立，這樣不僅操作簡單還能在短時間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，然而食品基質(zhì)成分復(fù)雜多樣對微生物生長影響大，細菌在培養(yǎng)基中的增殖并不能代表食品基質(zhì)中的真實狀態(tài)，建立的微生物預(yù)測模型準(zhǔn)確性也受到局限。食品及其原料自然狀態(tài)下會存在多種微生物混居一起，針對某種純培養(yǎng)細菌預(yù)測模型的建立則首先需要對食品基質(zhì)進行滅菌處理，然而高溫等方式滅菌后的食品基質(zhì)會被改變，不能代表其真實狀態(tài)[27-28]。本研究對冷鮮豬肉僅進行了簡單機械攪碎，未進行滅菌處理，通過GFP和抗生素抗性雙重選擇既實現(xiàn)了對食品基質(zhì)自然狀態(tài)下大腸桿菌的選擇性培養(yǎng)和追蹤檢測，也提高了預(yù)測模型的實用和準(zhǔn)確性。GFP作為報告基因應(yīng)用廣泛，有研究報道成功構(gòu)建了增強型綠色熒光蛋白在DH5α大腸桿菌中的表達，減少了篩選鑒定的工作量，提高了工作效率[18]。本研究中也成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達GFP的大腸桿菌DH5α，用于對食品中大腸桿菌生長繁殖情況追蹤檢測方法的改進具有十分重要的意義?；谶@種方法改進，本研究建立的Gompertz模型、平方根模型和響應(yīng)面模型均能較好預(yù)測一定溫度下大腸桿菌在冷鮮豬肉中變化規(guī)律，為產(chǎn)品貯存條件、衛(wèi)生安全關(guān)鍵控制點和貨架期研究提供有效方法和理論支持。

4 結(jié) 論

本研究基于對綠色熒光蛋白標(biāo)記大腸桿菌的定量追蹤檢測，構(gòu)建了冷鮮豬肉中大腸桿菌生長預(yù)測模型，得出以下主要結(jié)論：

1）通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）的標(biāo)記菌株。定量接種后基于GFP報告基因和氨芐青霉素抗性雙選擇標(biāo)記可以實現(xiàn)冷鮮豬肉中大腸桿菌的追蹤檢測。

2）以絞碎的冷鮮豬肉為基質(zhì)，采用Gompertz 模型擬合其中大腸桿菌生長情況，結(jié)果揭示0～20 ℃條件下Gompertz 模型預(yù)測結(jié)果能夠較準(zhǔn)確反映大腸桿菌的實際生長情況，模型決定系數(shù)2為0.96～0.99。模型偏差值和準(zhǔn)確值均接近1，擬合度良好。冷鮮豬肉作為細菌培養(yǎng)基質(zhì)未經(jīng)過高溫除菌處理，更能真實反映實際生產(chǎn)產(chǎn)品中微生物變化規(guī)律。

冷鮮肉中大腸桿菌生長溫度和最大比生長速率的平方根模型、生長溫度與遲滯期倒數(shù)的平方根模型擬合效果良好，其決定系數(shù)2分別為0.862和0.948。溫度和時間雙因素響應(yīng)面模型揭示2個因素對大腸桿菌的生長均有明顯影響，2者交互作用明顯（<0.05)，模型決定系數(shù)2為0.815。響應(yīng)面模型能夠有效擬合冷鮮豬肉中大腸桿菌生長變化規(guī)律，為生產(chǎn)實踐中冷鮮豬肉產(chǎn)品儲存條件及貨架期預(yù)測提供理論依據(jù)。

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Construction of the prediction model forin chilled pork using green fluorescent protein

Liu Bianfang, Hu Huifan, Zhang Yikui, Cai Jin, Du Shuangkui, Li Junli, Cao Mengqian, Lyu Xin※

(,,712100,)

Predicting dynamic changes of microorganisms can contribute to the rapid assessment of food safety for the shelf life in food prediction.originated from human or animal intestines are the main spoilage bacteria in fresh and chilled meat products. It is highly demanding to predict and monitor the changes ofin the chilled pork to ensure the safety and quality of food products. In this study, the green fluorescent protein plasmid (pGFP) with ampicillin resistance was transferred intoDH5ɑ by chemical transformation, thereby to construct a GFP labeledDH5ɑ strain. After quantitative inoculation of labeled strain in the chilled pork that was simply mechanically mashed, the dilution plate was used to detect the growth ofat different temperatures, using the GFP reporter gene and ampicillin resistance. The Gompertz model, the square root model, and the response surface equation were used to fit the number of bacteria, further to construct a mathematical prediction model. The results showed that the Gompertz model had a good fitting effect onin fresh pork, where the determination coefficient2were 0.96-0.99 at 0-20℃, and 0.79 at 24℃, respectively. The Gompertz model indicated that the growth ofwas very slow in the cold fresh pork at 0-8℃, and the lag phase duration (LPD) was over 40 h. It inferred that the growth rate ofwas significantly inhibited by the temperature, when the storage temperature of fresh pork was lower than 8℃. The two square root models had good fitting effects, which described the relationship between temperature and the square root of the maximum specific growth rate, and the relationship between temperature and the square root of reciprocal of LPD, where the determination coefficient2were 0.862 and 0.948, respectively. The response surface model demonstrated that there were significant effects of time and temperature on the growth ofin fresh pork, where the interaction between the two factors was significant (<0.05), with the2of 0.815. In the verification test, the prediction model revealed that the bias factor (B) and accuracy factor (A) were close to 1, indicating high accuracy and adaptability of the model. These models could effectively fit the growth rule ofin the chilled pork, providing a sound theoretical basis to predict bacterial change during product storage.

temperature; models;chilledpork;; tracking and detection; Gompertz prediction model

劉變芳，胡輝帆，張義奎，等. 基于綠色熒光蛋白的冷鮮豬肉中大腸桿菌預(yù)測模型的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2021，37(1)：299-305.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035 http://www.tcsae.org

Liu Bianfang, Hu Huifan, Zhang Yikui, et al. Construction of the prediction model forin chilled pork using green fluorescent protein[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(1): 299-305. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035 http://www.tcsae.org

2020-09-10

2020-12-15

國家自然基金面上項目（項目編號31972043）

劉變芳，博士，副教授。研究方向為食品安全、食品微生物。Email：bfliu9509@163.com

呂欣，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為食品生物技術(shù)。Email：xinlu@nwsuaf.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035

TS201.3

A

1002-6819(2021)-01-0299-07