辣椒疫霉生物學(xué)性狀的遺傳與變異研究

劉冬，李萍，高智謀

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥230036)

疫霉菌的菌絲生長(zhǎng)速率在無性后代通?？梢苑€(wěn)定遺傳，在有性后代基本上都會(huì)發(fā)生明顯變異。然而，生長(zhǎng)速率在部分疫霉菌的無性后代會(huì)發(fā)生變異[1]；部分苧麻疫霉菌株生長(zhǎng)速率在有性后代可穩(wěn)定遺傳，認(rèn)為控制生長(zhǎng)速率的遺傳因子是純合的[2]。一般而言，疫霉菌的菌落形態(tài)在無性后代可以穩(wěn)定遺傳，在有性后代發(fā)生復(fù)雜變異，如寄生疫霉、掘氏疫霉、苧麻疫霉、惡疫霉和樟疫霉等的菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代均可以穩(wěn)定遺傳[1-4]。但也有例外，研究人員發(fā)現(xiàn)大雄疫霉中某些菌株菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代發(fā)生很大變異[5]；苧麻疫霉的部分菌株菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代出現(xiàn)親本型(P型)和變異型(S型)，S型菌株菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代繼續(xù)分離為P型和S型[6]。疫霉菌的交配型存在十分復(fù)雜的遺傳與變異現(xiàn)象，不同的研究人員對(duì)于疫霉菌交配型的遺傳機(jī)理和背景的觀點(diǎn)不全一致，較為一致的意見認(rèn)為是由細(xì)胞核遺傳因子控制交配型的。關(guān)于辣椒疫霉不同致病力菌株生物學(xué)性狀的遺傳與變異研究鮮有報(bào)道，辣椒疫霉菌落形態(tài)在無性后代穩(wěn)定遺傳，辣椒疫霉種內(nèi)交配產(chǎn)生的卵孢子后代出現(xiàn)了明顯不同于親本類型的菌落形態(tài)[7-8]。本文對(duì)不同致病力的辣椒疫霉的生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)和異宗配合性狀在單游動(dòng)孢子后代和自交單卵孢后代進(jìn)行了遺傳與變異研究，旨在揭示各個(gè)生物學(xué)性狀的遺傳特征、遺傳多樣性及遺傳變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)苯芬呙筆. capsici菌株HF4(A2型，強(qiáng)致病力)、HN3(A1型，弱致病力)、HX2(A2型，弱致病力)和FY2(A1型，強(qiáng)致病力)分別采集于安徽省合肥市、淮南市、巢湖市和阜陽(yáng)市。標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株A1交配型(P991)和A2交配型(P731)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授惠贈(zèng)。

1.2 供試培養(yǎng)基

10%的V8培養(yǎng)液和胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)配制參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》進(jìn)行，分別用于誘導(dǎo)游動(dòng)孢子囊和卵孢子的產(chǎn)生，以及辣椒疫霉的培養(yǎng)和挑選的單孢株培養(yǎng)，建立單游動(dòng)孢子無性系。水瓊脂培養(yǎng)基(WA)和S+L培養(yǎng)基分別用于辣椒疫霉單孢分離和卵孢子的萌發(fā)，參考戚仁德等人的報(bào)道的方法配制。

1.3 單游動(dòng)孢子無性系的建立

1.3.1 誘導(dǎo)孢子囊的產(chǎn)生及游動(dòng)孢子釋放 參照Wu等人的方法[9]，誘導(dǎo)孢子囊的產(chǎn)生及游動(dòng)孢子釋放。CA上培養(yǎng)的辣椒疫霉取菌碟6～8塊，在10%V8培養(yǎng)液中25 ℃黑暗培養(yǎng)72 h后，無菌水誘導(dǎo)產(chǎn)生大量孢子囊。低溫5℃處理10～15 min，置于室溫下30 min，可見游動(dòng)孢子。

1.3.2 單游動(dòng)孢子的分離及單孢系的建立 單游動(dòng)孢子的分離及單孢系的建立參考戚仁德等人報(bào)道的方法[7,10]，在水瓊脂培養(yǎng)基平板上加入游動(dòng)孢子懸浮液約150 uL涂布均勻，25 ℃下黑暗培養(yǎng)12 h產(chǎn)生芽管。用10×10倍顯微鏡鏡檢，將僅有一個(gè)萌發(fā)的游動(dòng)孢子及其芽管連同周圍的培養(yǎng)基移至CA培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d形成單游動(dòng)孢子菌落，即為單游動(dòng)孢子株。以各菌株的單游動(dòng)孢子株為親本，分別建立第一代游動(dòng)孢子株系ZG1；從ZG1群體中隨機(jī)挑選一個(gè)單孢株，以其為親本建立第二代ZG2；再?gòu)腪G2群體中隨機(jī)挑選一個(gè)單孢株，以其為親本建立第三代ZG3。

1.4 單卵孢株群體的建立

1.4.1 卵孢子產(chǎn)生的誘導(dǎo)及萌發(fā) 采用聚碳膜間隔配對(duì)法[11]誘導(dǎo)產(chǎn)生卵孢子，將供試菌株和對(duì)應(yīng)交配型的辣椒疫霉菌株同時(shí)在V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d(黑暗25℃)，將菌落切成小塊，取供試菌株的菌絲塊于空培養(yǎng)皿，菌絲面朝上，覆蓋滅菌的聚碳膜，再將對(duì)應(yīng)交配型菌株的菌絲塊置于聚碳膜上方，菌絲面朝下，其位置正好在聚碳膜下方的菌絲塊上。輕壓使上下菌絲塊與聚碳膜緊貼，20～24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)60～90 d。

1.4.2 誘導(dǎo)卵孢子的萌發(fā)及單卵孢株群體的建立 參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》制備卵孢子懸浮液，在S+L培養(yǎng)基(含有五氯硝基苯、多菌靈、青霉素、利福平各50 μg/mL)平板上加卵孢子懸浮液200 μL，涂布均勻。置于25 ℃在16 h日光燈8 h黑光燈交替條件下照射3～14 d。單卵孢株群體的建立與單孢系的建立操作相似，按照“1.3.2”操作完成。

1.5 生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)及異宗配合性狀的測(cè)定

參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》 在CA平板上培養(yǎng)單孢株，記錄菌落直徑和菌落形態(tài)，每個(gè)菌株重復(fù)3次，并以各自親本菌株作為對(duì)照。交配型的測(cè)定采用直接配對(duì)法進(jìn)行，將供試單孢菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān) 991和P 731于CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d，分別取菌落邊緣放入10%的V8平板上(間隔4 cm)。黑暗25 ℃培養(yǎng)10～15 d后，置于10×10倍顯微鏡下檢查兩菌落交界處及其周圍是否有藏卵器、雄器和卵孢子。各供試單孢分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株配對(duì)，并與自身相配對(duì)作為對(duì)照，各3次重復(fù)。確定交配型。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)性狀在單游動(dòng)孢子后代的遺傳與變異

2.1.1 生長(zhǎng)速率在單游動(dòng)孢子后代的遺傳與變異 對(duì)辣椒疫霉的單游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定，供試菌株的單游動(dòng)孢子后代(ZG1、ZG2和ZG3)的生長(zhǎng)速率均與各自親本相似(表1和圖1)。菌株HN3單游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率分布在6.96～8.17 mm/d(親本生長(zhǎng)速率為7.71 mm/d；表1)，平均值為7.53、7.65、7.61 mm/d，變異系數(shù)分別為3.76%、3.78%和3.88%。

表1 辣椒疫霉菌株游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率

菌株HF4單游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率在7.04～8.08 mm/d范圍內(nèi)，平均值為7.57、7.52、7.47 mm/d，變異系數(shù)分別為3.10%、3.61%和3.36%。菌株FY2單游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率平均值為6.71、6.80、6.76 mm/d，變異系數(shù)分別為2.91%、2.61%和2.87%。菌株HX2單游動(dòng)孢子后代的生長(zhǎng)速率平均值為7.67、7.63、7.53 mm/d，變異系數(shù)分別為4.04%、3.51%和3.56%。由頻次分布圖1可知，菌株FY2的無性后代群體88%以上菌株的生長(zhǎng)速率為6.00～7.00 mm/d；菌株HX2的無性后代群體中，86%以上菌株的生長(zhǎng)速率為7.00～8.00 mm/d。單游動(dòng)孢子后代菌株間及其親本生長(zhǎng)速率無顯差異，辣椒疫霉生長(zhǎng)速率在單游動(dòng)孢子后代連續(xù)三代可穩(wěn)定遺傳。

2.1.2 菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代的遺傳與變異 辣椒疫霉單游動(dòng)孢子后代(ZG1、ZG2和ZG3各50株)的菌落形態(tài)與親本相同。單孢后代在CA平板上生長(zhǎng)2 d后，菌落呈圓形，邊緣較整齊、光滑，質(zhì)地均勻，氣生菌絲稀疏、白色絮狀(圖2)。即菌落形態(tài)在單游動(dòng)孢子后代可穩(wěn)定遺傳。

2.1.3 交配型在單游動(dòng)孢子后代的遺傳 以不同交配型菌株的單游動(dòng)孢子株為親本，分別建立單游動(dòng)孢子ZG1、ZG2和ZG3群體，測(cè)定每菌株各單孢后代中各50個(gè)單孢株的交配型。結(jié)果表明菌株FY2和HN3與其連續(xù)3代的單游動(dòng)孢子的交配型相同，均為A1交配型，未發(fā)現(xiàn)其它交配型。菌株HF4和HX2與其連續(xù)3代的單游動(dòng)孢子后代的交配型相同，均為A2交配型，未發(fā)現(xiàn)其它交配型。結(jié)果顯示辣椒疫霉親本的異宗配合性狀在其游動(dòng)孢子無性后代中的遺傳非常穩(wěn)定，排除了親本為異核體的可能性[12]。

2.2 生物學(xué)性狀在自交后代的遺傳與變異

2.2.1 生長(zhǎng)速率在自交后代的遺傳與變異 辣椒疫霉菌株HN3、HF4、FY2和HX2的自交卵孢子第一代的生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明各菌株單卵孢后代的生長(zhǎng)速率發(fā)生了明顯的變異(表2，圖3)。上述四個(gè)單卵孢株群體內(nèi)菌株間及其與親本間的生長(zhǎng)速率差異顯著。其中，菌株HN3單卵孢后代群體(30株)的生長(zhǎng)速率為1.42～7.50 mm/d，LSD測(cè)驗(yàn)30個(gè)單卵孢株中有3株生長(zhǎng)速率與親本相似，其余菌株比親本明顯減慢，變異系數(shù)為27.85%，遠(yuǎn)高于HN3單游動(dòng)孢子后代的變異系數(shù)。菌株HF4單卵孢后代群體(30株)的生長(zhǎng)速率為2.42～7.79 mm/d，其變異系數(shù)為27.98%，高于HF4單游動(dòng)孢子后代的變異系數(shù)。菌株FY2單卵孢后代群體(65株)的生長(zhǎng)速率為1.91～7.39 mm/d，LSD測(cè)驗(yàn)變異系數(shù)為21.97%，高于FY2單游動(dòng)孢子后代的變異系數(shù)；菌株HX2單卵孢后代群體(66株)的生長(zhǎng)速率為2.11～7.89 mm/d，66個(gè)單卵孢株中有2株生長(zhǎng)速率與親本相似，變異系數(shù)為21.73%，高于HX2單游動(dòng)孢子后代的變異系數(shù)。結(jié)果表明辣椒疫霉菌株生長(zhǎng)速率性狀在自交后代的變異明顯大于其單游動(dòng)孢子后代。

表2 辣椒疫霉菌株自交卵孢子后代的生長(zhǎng)速率

2.2.2 菌落形態(tài)在自交后代的遺傳與變異 各菌株單卵孢株菌落形態(tài)在自交后代的遺傳結(jié)果如圖4和5所示，菌株HX2在自交S1代單卵孢株群體中除了親本型(P型)外，還出現(xiàn)5種菌落形態(tài)分別為。(1)菌落圓形至近圓形，邊緣整齊但粗糙，菌絲分布均勻但稀疏(HX2S1-54)；(2)菌落形態(tài)不穩(wěn)定，易變異，邊緣不整齊(HX2S1-51)；(3)菌落圓形，邊緣整齊光滑，菌絲致密呈放射狀，無氣生菌絲，生長(zhǎng)極其緩慢(HX2S1-36)；(4)菌落圓形或近圓形，邊緣較粗糙，質(zhì)地均勻，表面尤其是中部有氣生菌絲(HX2S1-12)；(5)邊緣光滑不整齊，氣生菌絲呈花點(diǎn)狀(HX2S1-51)。菌株FY2在自交S1代單卵孢株群體中除了出現(xiàn)親本型外，還出現(xiàn)其他不同類型的菌落形態(tài)(圖6-5)，表明菌落形態(tài)在單卵孢株后代發(fā)生變異。同樣地，菌株HN3和HF4單卵孢株后代的菌落形態(tài)除了與親本一致外，部分后代發(fā)生了變異。

2.2.3 交配型在自交后代的遺傳與變異 分別測(cè)定了在4個(gè)來自于不同地區(qū)的辣椒疫霉異宗配合性狀在自交S1代的遺傳穩(wěn)定性(表3)。菌株HN3、HF4和FY2的自交S1后代中出現(xiàn)了A1和A2兩種交配型，未出現(xiàn)自育型的A1A2交配型，各菌株單卵孢后代A1交配型的比例分別為36.7%、30%和39.1%；A2型菌株HX2的S1代中出現(xiàn)了A1、A2和A1,A2三種交配型，未出現(xiàn)自育型的A1A2交配型，其中A1,A2交配型的比例為4.8%，A1和A2交配型的比例分別為32.3%和62.9%。上述結(jié)果表明，辣椒疫霉A1、A2交配型性狀在自交S1代中不能夠穩(wěn)定遺傳。

表3 辣椒疫霉交配型在自交后代中的遺傳

3 小結(jié)

本文中辣椒疫霉的交配型在無性繁殖后代中能穩(wěn)定遺傳，在有自交后代群體中發(fā)生變異，且自交S1代中不同交配型的分離比例無規(guī)律可循，不符合孟德爾遺傳分離的規(guī)律，因此，本研究認(rèn)為辣椒疫霉的交配型是由細(xì)胞質(zhì)基因控制的，但關(guān)于交配型的遺傳與變異還需進(jìn)一步探討其機(jī)制。