鹽生植物鹽爪爪液泡膜鈉氫反向運(yùn)輸載體基因(KfNHX1)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥的耐鹽性鑒定

銀芳柳，毛曉菲，曾幼玲

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的主要因素之一。為了應(yīng)對(duì)鹽脅迫，植物已進(jìn)化出多種生理和分子機(jī)制，如滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)隔化機(jī)制等[1]。其中離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持植物細(xì)胞的正常生理代謝非常重要[2]。研究離子穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因?qū)τ谥参锬望}性有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX1和SOS1)是一類(lèi)在離子穩(wěn)態(tài)中起重要作用的膜蛋白，屬于單價(jià)陽(yáng)離子/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體CPA1家族成員[2]。SOS1位于質(zhì)膜上，在質(zhì)外體中排出Na+[3]；而NHX1位于液泡膜中，將Na+泵入液泡中來(lái)降低胞質(zhì)中的Na+濃度[4]。通過(guò)調(diào)節(jié)胞間離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)保持適當(dāng)?shù)碾x子濃度，從而避免Na+在胞質(zhì)中的毒害。植物液泡膜Na+/H+反向運(yùn)輸載體基因(NHX1)已經(jīng)從多種植物中克隆，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[6]、甜菜(Betavulgaris)[7]、海馬齒(Sesuviumportulacastrum)[8]，其過(guò)表達(dá)都能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽脅迫耐受性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】藜科鹽生灌木鹽爪爪在西北鹽堿沙漠地區(qū)廣布，其莖葉肉質(zhì)化，具有極強(qiáng)的耐鹽能力[9]。研究是基于已克隆的鹽爪爪KfNHX1基因[10]，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥對(duì)其耐鹽性進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鹽爪爪KfNHX1基因擬南芥的耐鹽性，通過(guò)基因組PCR和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因株系，在鹽脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)鹽爪爪KfNHX1擬南芥的萌發(fā)率、根長(zhǎng)、離子含量及表型分析，為鹽爪爪KfNHX1基因的耐鹽分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生型擬南芥(Col)和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在1/2 MS(Murashige and Skoog medium)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周，移栽至花土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1)中。培養(yǎng)條件：溫度為22℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

BamH I、SalI等限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaq、DNA polymerase、dNTP Mixture、DNA Marker、Oligo (dT)18Primer、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H) 和Ribonuclease Inhibitor購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；植物基因組提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其余常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

將KfNHX1(AY825250)的開(kāi)放閱讀框(ORF)克隆到pCAMBIA1301質(zhì)粒的35S啟動(dòng)子和PolyA信號(hào)之間(BamH I、SalI)。將成功構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用花序浸染法浸染擬南芥，收獲種子。35 mg/L潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因種子，篩選T2代符合3∶1的轉(zhuǎn)基因株系，T3代純合株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥的PCR及RT-PCR鑒定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取植物樣本的基因組和總RNA。通過(guò)KfNHX1全長(zhǎng)編碼序列ORF的引物P1(5'-TCAGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGC-3')和P2(5'-GGAGTCGACCTATGTTCTGTCTAGCAAATTGT-3')擴(kuò)增擬南芥基因組中的KfNHX1；使用KfNHX1部分編碼序列引物P3(5'-ATAATCAGTTTACAAGGTCAGGGC-3')和P4(5'-TAATAGTGGACGGTGTGAGTAGGT-3')進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增擬南芥cDNA中的KfNHX1。

1.2.3 NaCl和ABA脅迫處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥耐性

野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合種子進(jìn)行表面滅菌并在4℃ 放置2 d，于植物光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3.1 種子萌發(fā)率

將野生型和轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子播種在含有0、50、75、100、125、150 mM NaCl和1 μM ABA的1/2 MS培養(yǎng)基中，當(dāng)種子出現(xiàn)子葉時(shí)記錄為萌發(fā)，每天的萌發(fā)率為發(fā)芽種子數(shù)與種子總數(shù)之比。每處理共120粒種子用于測(cè)定萌發(fā)率。

1.2.3.2 苗期根長(zhǎng)

將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗(5日齡)轉(zhuǎn)移至含有0、120 mM NaCl和10、15 μM ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，于植物光照培養(yǎng)室中豎直培養(yǎng)10 d后拍照，采用ImageJ軟件測(cè)定根長(zhǎng)。

1.2.3.3 成苗的脅迫表型及Na+和K+含量

用逐漸增加到200 mM NaCl澆灌生長(zhǎng)5周的轉(zhuǎn)基因擬南芥，鹽脅迫處理至第15 d拍照。在脅迫第7 d時(shí)取擬南芥葉片，置于60℃的烘箱中烘干至恒重。用HNO3處理樣品，煮沸至酸液揮發(fā)盡，用超純水定容。使用原子吸收分光光度計(jì)(Z-8000，Hitachi，Tokyo)測(cè)定Na+和K+含量，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±SE(n=3)并且進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。進(jìn)行多重比較以確定組間和組內(nèi)之間的顯著差異。顯著性水平為P< 0.05(*)；P< 0.01(**)；P< 0.001(***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定

研究表明，將KfNHX1編碼序列構(gòu)建至具有潮霉素抗性標(biāo)記的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301中。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。使用潮霉素抗性(HPT)篩選T2代具有3∶1的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)而獲得T3代純合株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)行分子檢測(cè)。通過(guò)基因組PCR和RT-PCR檢測(cè)，均在轉(zhuǎn)基因株系中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，KfNHX1已整合到擬南芥的基因組中，并在RNA水平上轉(zhuǎn)錄表達(dá)。圖1,圖2

圖 1 pCAMBIA1301-CaMV35S-KfNHX1的構(gòu)建圖譜Fig.1 Physical map of pCAMBIA1301-CaMV35S-KfNHX1 construct

注：A、B：分別為轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥中的基因組PCR和RT-PCR分析；M：DL2000 Marker；1、6：陰性對(duì)照；2、7：陽(yáng)性對(duì)照；3、8：野生型；4、5、9、10：轉(zhuǎn)基因株系KN6和KN14

2.2 鹽和ABA脅迫條件下轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥的種子萌發(fā)

研究表明，野生型與T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子分別在不同濃度(0、50、75、100、125、150 mM)的NaCl以及外源施加ABA(1 μM ABA)處理6 d后測(cè)定萌發(fā)率。50 mM NaCl和對(duì)照條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異，而在75至125 mM NaCl和1 μM ABA處理后，野生型種子萌發(fā)率僅約40%，而KN6株系超過(guò)80%。相較于野生型，轉(zhuǎn)基因株系在種子萌發(fā)率方面表現(xiàn)對(duì)鹽和ABA的抗性。圖3，圖4

注：A、B：分別為在0、50、75、100、125、150 mM NaCl脅迫下WT和KN6的萌發(fā)表型和萌發(fā)率

注：A、B：分別為ABA處理下WT和KN6的萌發(fā)表型和萌發(fā)率

2.3 鹽脅迫和ABA處理下轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥的抗性

研究表明，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于野生型，而不處理的對(duì)照擬南芥的生長(zhǎng)無(wú)差異，KfNHX1基因能增強(qiáng)擬南芥苗期的耐鹽性。同樣，在添加10 μM ABA脅迫激素的培養(yǎng)基上處理10 d，轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)良好，葉片較大，而野生型的葉片黃化且生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。轉(zhuǎn)化KfNHX1基因的擬南芥能夠降低擬南芥苗期對(duì)ABA敏感性。圖5

注：A、B：分別為正常生長(zhǎng)和120 mM NaCl脅迫下的根長(zhǎng)表型；C：根長(zhǎng)分析；D：10 μM 和15 μM ABA脅迫下的生長(zhǎng)表型

研究表明，成苗的擬南芥，在正常條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)良好且無(wú)差異，200 mM NaCl脅迫15 d時(shí)，野生型植株大多生長(zhǎng)抑制、枯萎甚至死亡，轉(zhuǎn)基因擬南芥普遍長(zhǎng)勢(shì)較好。利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉中的Na+和K+含量的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中Na+和K+含量都高于野生型。KfNHX1基因可能增強(qiáng)了將Na+區(qū)隔化至液泡的能力，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。圖6

注：200 mM NaCl處理下的擬南芥的生長(zhǎng)表型(A)、擬南芥葉中的Na+含量(B)和K+含量(C)

3 討 論

高鹽造成植物水分虧缺、離子毒害，是世界農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因[11]。其中液泡膜Na+/H+反向運(yùn)輸載體能將胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化至液泡中，維持胞質(zhì)內(nèi)較低的Na+水平，來(lái)減輕Na+對(duì)植物造成傷害[12]。

在擬南芥、番茄、油菜和棉花中過(guò)量表達(dá)AtNHX1，在200 mM Nacl處理下均能提高轉(zhuǎn)基因的耐鹽性。其中轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)量增加和產(chǎn)生更多棉纖維的現(xiàn)象[13-16]。將互花米草SaNHX2基因過(guò)表達(dá)至擬南芥，在200 mM NaCl脅迫條件下，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素含量更高、根更長(zhǎng)，和脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)量增加明顯[17]。過(guò)量表達(dá)棗樹(shù)PdNHX6基因至擬南芥，轉(zhuǎn)基因株系的Na+和K+含量均高于野生型，PdNHX6可能增強(qiáng)了擬南芥將Na+區(qū)隔化至液泡的能力，從而提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[18]。

鹽爪爪是生長(zhǎng)于鹽堿荒漠區(qū)多年生積鹽鹽生植物，葉肉質(zhì)、多汁[9]。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將KfNHX1基因轉(zhuǎn)化至擬南芥進(jìn)行耐鹽功能分析。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率、根長(zhǎng)和成苗的生長(zhǎng)表型明顯優(yōu)于野生型，Na+和K+含量也高于野生型，表明鹽爪爪KfNHX1能夠增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性。這與文獻(xiàn)中報(bào)道在擬南芥中GhNHX1[19]、ZmNHX1[20]、SsNHX1[6]和MsNHX1[21]的過(guò)表達(dá)通過(guò)提高積累Na+來(lái)增強(qiáng)其耐受性的結(jié)果一致。

ABA是一種重要的植物脅迫激素，參與種子休眠、萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)等發(fā)育過(guò)程及植物的非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[22-24]。過(guò)表達(dá)水稻OsPP108的擬南芥植株在種子萌發(fā)、根生長(zhǎng)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)ABA高度不敏感，對(duì)高鹽和甘露醇脅迫耐受性強(qiáng)[25]。在外源ABA處理下，轉(zhuǎn)大麥HbMBF1a擬南芥都具有較高的子葉綠化率、幼苗根長(zhǎng)和逆境響應(yīng)基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的ABA不敏感性，是ABA反應(yīng)的正調(diào)控因子[26]。也開(kāi)展了轉(zhuǎn)KfNHX1基因擬南芥對(duì)ABA的脅迫耐受性，通過(guò)萌發(fā)率和幼苗的生長(zhǎng)表型來(lái)看，轉(zhuǎn)基因擬南芥降低了對(duì)ABA的敏感性，與一些文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[27-28]。

4 結(jié) 論

以農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸染法將KfNHX1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中并獲得了T3代純合株系。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥種子的萌發(fā)率和根長(zhǎng)明顯高于野生型。結(jié)合200 mM NaCl脅迫處理15 d下的擬南芥成苗表型，相較野生型葉片萎黃和死亡，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況較好，且積累了較高的Na+和K+。異源表達(dá)KfNHX1能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。