DNA條形碼技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定中國(guó)一新紀(jì)錄種-艾弗斯曼多眼蝶

郭文韜，努日耶·木合太爾，羅順剛，鐘 問，胡紅英

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】多眼蝶屬KiriniaMoore隸屬于鱗翅目Lepidoptera、眼蝶科Satyridae，世界已知6種均分布于古北區(qū)，中國(guó)目前已知1種：多眼蝶Kiriniaepaminondas，主要分布于北京、黑龍江、遼寧、山東、河南等地[1]。通過對(duì)近年來在新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣中華福壽山景區(qū)采集的蝴蝶標(biāo)本進(jìn)行整理，發(fā)現(xiàn)了該屬1中國(guó)新紀(jì)錄種：艾弗斯曼多眼蝶Kiriniaeversmanni。目前關(guān)于鱗翅目中的分類鑒定主要依據(jù)翅和雄性外生殖器的特征[2]，主要以物種間因外生殖器的不同形成的種間生殖隔離為出發(fā)點(diǎn)，雄性外生殖器的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且種間差異明顯為據(jù)[3]。研究將雄性外生殖器的形態(tài)特征與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合，對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行識(shí)別和鑒定，為其鑒定提供可靠依據(jù)，同時(shí)豐富國(guó)內(nèi)多眼蝶屬物種記錄情況，為該屬物種的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。 【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于多眼蝶屬物種的相關(guān)研究工作甚少，且關(guān)于該屬的詳細(xì)鑒定工作暫無研究。Hebert等[4]在提出DNA條形碼技術(shù)后將這一技術(shù)應(yīng)用到昆蟲鑒定，分析了200個(gè)親緣關(guān)系較近的鱗翅目昆蟲的COI片段，結(jié)果表明，200個(gè)鱗翅目昆蟲100%被準(zhǔn)確區(qū)分；Hajibabaei等[5]研究了鱗翅目中的弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)和大蛾科(Saturniidae)521個(gè)物種4 260個(gè)樣本，97.9% 的物種能夠準(zhǔn)確無誤的被鑒定，證明DNA條形碼對(duì)于物種鑒定的有效性；Vladimir等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)乩砀采w范圍擴(kuò)大后并不妨礙物種分子水平的鑒定，結(jié)果表明，即使是在一個(gè)大的地理區(qū)域的分類單元采樣，DNA條形碼仍然是一個(gè)有效的識(shí)別工具。武宇鵬[7]為檢驗(yàn)DNA條形碼在鱗翅目中鑒定的可行性選取71頭夜蛾科Noctuidae標(biāo)本利用系統(tǒng)發(fā)育樹、遺傳距離、閾值等方法進(jìn)行了鑒定和比較分析，發(fā)現(xiàn)基于cox1基因的鑒定成功率達(dá)到了100% ，而基于28S則很低，為64.8%。用不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定結(jié)果均相同。然而DNA條形碼也有一些爭(zhēng)議，有些分類學(xué)家認(rèn)為DNA條形碼作為物種分類鑒定依據(jù)時(shí)其分子數(shù)據(jù)權(quán)重過大，片段單一，以及受限于數(shù)據(jù)庫中參照序列的多少等[8]。DNA條形碼仍不失為一種極為有效的昆蟲物種鑒定工具，如ITS2[9]、rRNA[10]以及cytb[11]等適當(dāng)增加和補(bǔ)充一些其他基因序列信息也很必要。Bonfantt等[12]研究了新熱帶螯蛺蝶亞科Charaxinae 13屬31種的雄性外生殖器超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其在屬、種之間均有明顯差異。洪健等[13]對(duì)虎鳳蝶屬Luehdorfia雄外生殖器的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，認(rèn)為抱握器，鉤形突、陽莖、陽莖軛片等部位超微結(jié)構(gòu)的差異可作為虎鳳蝶屬不同種的形態(tài)鑒定依據(jù)；蔣玲玲、曹文秋等[14-15]通過對(duì)雄性外生殖器的結(jié)構(gòu)比較對(duì)云粉蝶屬Pontiadaplidice以及新疆7種具有代表性的蛺蝶科(Nymphalidae)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定并制作檢索表。隨著對(duì)整合分類學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷加深，對(duì)于物種的鑒定技術(shù)的綜合運(yùn)用也越來越廣泛，集形態(tài)、分子及生態(tài)數(shù)據(jù)為一體的綜合分類法將會(huì)使昆蟲未來物種鑒定更為科學(xué)和準(zhǔn)確[16-18]。如陳光輝[19 ]等通過DNA條形碼技術(shù)與外生殖器特征鑒定相結(jié)合的方法成功鑒定榆綠毛螢葉甲Pyrrhaltaaenescens。 【本研究切入點(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)對(duì)多眼蝶屬的相關(guān)研究極少。在新疆伊犁州霍城縣清水河鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)該屬中國(guó)新紀(jì)錄種，利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合其雄性外生殖器特征和翅面結(jié)構(gòu)對(duì)該物種進(jìn)行描述鑒定，為該物種提供更多的分類特征。 【擬解決的關(guān)鍵問題】采集艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本， 運(yùn)用整合分類學(xué)方法，為該中國(guó)新紀(jì)錄種提供可靠鑒定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 昆蟲

艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本采于2016～2017年，采集地點(diǎn)為新疆霍城縣清水河鎮(zhèn)大西溝鄉(xiāng)中華福壽山景區(qū)廟內(nèi)。標(biāo)本保存于新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院昆蟲標(biāo)本館。表1

表1 標(biāo)本采集信息Table 1 Collecting information of specimens

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑

捕蟲網(wǎng)、三角紙袋、體視顯微鏡、解剖鏡、酒精燈、試管、鐵架臺(tái)、試管夾、10%KOH溶液、75%酒精、木餾油、丁香油、加拿大樹膠、PCR儀；電泳儀；凝膠成像儀等。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本采集與前期處理

通過捕蟲網(wǎng)采集到蝴蝶后，用雙手捏蝴蝶翅基部使其失去飛行能力，將蝴蝶裝至三角袋臨時(shí)保存至蝴蝶死亡后利用昆蟲針三角片和展翅板進(jìn)行展翅，放在通風(fēng)處使其干燥，附上標(biāo)簽后收入標(biāo)本盒保存。

1.2.2 雄性外生殖器標(biāo)本的制作、觀察及保存

將艾弗斯曼多眼蝶標(biāo)本編號(hào)1，2，3，剪下腹部末端1/3處(一般蝶類雄性外生殖器位于第9～10腹節(jié))剪下放置于試管中，加入約試管1/5容積的10%KOH溶液，將試管放置于酒精燈上均勻加熱直至溶液沸騰后保持7～8 min以溶解其肌肉組織，待溶液冷卻后用鑷子取出腹部置于75%酒精溶液中，在解剖鏡下用解剖針取出雄性外生殖器，用75%的酒精反復(fù)清洗去除附著于雄性外生殖器的透明絮狀物[12,20]。使用體視顯微鏡觀察洗凈的雄性外生殖器并進(jìn)行不同角度的拍照，之后在75%酒精中拆除雄性外生殖器，觀察并拍攝各個(gè)結(jié)構(gòu)。表1

永久保存，需將解剖處理后的雄性外生殖器置于木餾油中脫水20～25 min，之后取出置于丁香油中，待置于載玻片上吸干多余的丁香油用蓋玻片固定，用加拿大樹膠封片，最后將載玻片移入35℃的恒溫箱中烘干3～4 d后附上標(biāo)簽放入切片盒中保存。

1.2.3 DNA 的提取

將艾弗斯曼多眼蝶剩余腹部組織分別剪下于干凈離心管中研磨編號(hào)1，2，3，利用按照凱杰(QIAGEN)公司生產(chǎn)的血液/組織基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取艾弗斯曼多眼蝶DNA。

1.2.4 目的片段擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序

選用線粒體基因細(xì)胞色素氧化酶I(COI)的部分片段作為分子標(biāo)記，選用擴(kuò)增該片段的通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198作為引物，上游引物堿基序列：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物堿基序列：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL；上、下游引物各0.5 μL(引物濃度10 μmol/ L)，2×PCRMix預(yù)混液10 μL，DNA模板5 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，94℃50s，45～50℃退火，72℃50s，35℃循環(huán)，72℃10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物均用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓110V 20 min，待電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察，并拍照。利用純化試劑盒將目的片段電泳條帶單一且明亮的PCR產(chǎn)物再次純化。委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序。

1.2.5 目的序列拼接與確認(rèn)

利用DNAStar7.1.0的SeqMan Pro軟件查看序列峰圖質(zhì)量并進(jìn)行人工校對(duì)，將校對(duì)后的正、反向序列進(jìn)行序列拼接。將拼接好的艾弗斯曼多眼蝶COI基因序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)與分析，進(jìn)一步確認(rèn)測(cè)定的目標(biāo)序列來自多眼蝶屬昆蟲，排除因試驗(yàn)污染而導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾弗斯曼多眼蝶雄蟲翅面特征

研究表明，翅正面呈黃褐色，前后翅外緣呈黑色。前翅亞頂區(qū)有3個(gè)黑斑，中區(qū)具1個(gè)黑斑；后翅亞外緣區(qū)有1列黑圓斑。前翅反面中室有4條黑色豎紋，后翅反面中區(qū)到基區(qū)為黑褐色。前緣中區(qū)斑紋外帶白色，亞外緣區(qū)有6個(gè)黑色眼斑，黃眶白瞳。圖1

注：A：背面觀；B：腹面觀

2.2 艾弗斯曼多眼蝶雄性外生殖器結(jié)構(gòu)特征

研究表明，與鱗翅目大多數(shù)種類一樣，艾弗斯曼多眼蝶的雄性外生殖器由第9、10腹節(jié)特化而成，基本結(jié)構(gòu)主要由背兜 (tegumen)、基腹弧(vinculum)、陽莖(aedeagus)、鉤形突(uncus)、陽莖軛片(juxta)、囊形突(saccus) 、抱器瓣(valvae)等幾部分構(gòu)成。基腹弧條狀呈U型結(jié)構(gòu)；背兜較寬為馬鞍狀，腹面光滑；囊形突為頭粗尾細(xì)的管狀突起，長(zhǎng)寬比約為2∶1；抱器瓣為扁平囊狀，基部開口，抱器端圓滑，外緣外側(cè)著生密集而整齊的剛毛(圖3B，C)；鉤形突為末端尖鉤狀結(jié)構(gòu)，呈三角形，兩側(cè)外緣平滑；陽莖為棒狀，表面粗糙近透明段部位斜截式開口(圖3D)；陽莖軛片為盾狀結(jié)構(gòu)，正面呈U型。圖2，圖3

注：tg：背兜；vin：基腹??；ae：陽莖；un：鉤形突；jx：陽莖軛片；sa：囊形突； vla：抱器瓣

注：A：基腹弧將背兜與囊形突相連；B-C：抱器瓣側(cè)面觀；D：陽莖

2.3 艾弗斯曼多眼蝶COI基因條形碼

研究表明，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)試驗(yàn)選取的艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中1～3條帶為1號(hào)樣本，4～6條帶為2號(hào)樣本，7～9條帶為3號(hào)樣本。1，2號(hào)樣本條帶亮度強(qiáng)且單一，3號(hào)條帶亮度一般，均無其他干擾帶。圖4

圖4 艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of COI gene PCR products of Kirinia eversmanni

2.4 艾弗斯曼多眼蝶基因組序列

研究表明，3頭艾弗斯曼多眼蝶的基因序列相似性達(dá)到100%，其片段大小為696 bp，堿基平均含量分別為：A30%、C15%、G15%及T41%；序列中G+C含量為30%，A+T含量為71%，表現(xiàn)出明顯的A/T偏向性。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫所記錄物種Kiriniaeversmanni(登入號(hào)：FJ663540.1)的COI基因長(zhǎng)度相同且相似度高達(dá)99.70%，僅有部分單個(gè)堿基存在差異，說明試驗(yàn)所獲得的基因片段與數(shù)據(jù)庫中所記錄種為同一物種。圖5，圖6

圖5 3頭艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列對(duì)比Fig.5 COI gene sequence comparison between three Kirinia eversmanni

圖6 試驗(yàn)樣本COI基因與NCBI中艾弗斯曼多眼蝶序列比對(duì)Fig.6 Comparison results between the COI gene of the experimental sample and the sequence of Kirinia eversmanni in NCBI

艾弗斯曼多眼蝶翅面正面呈黃褐色，前后翅外緣呈黑色，前翅亞頂區(qū)有3個(gè)黑斑，中區(qū)具1個(gè)黑斑，后翅反面中區(qū)到基區(qū)為黑褐色；雄性外生殖器囊形突為頭粗尾細(xì)的管狀突起，長(zhǎng)寬比約為2∶1，抱器瓣抱器端圓滑，外緣外側(cè)著生密集而整齊的剛毛，鉤形突為末端尖鉤狀結(jié)構(gòu)，呈三角形，陽莖為棒狀，盲囊端無彎曲；COI基因序列長(zhǎng)度為696 bp，表現(xiàn)出明顯的A/T偏向性。

3 討 論

3.1 艾弗斯曼多眼蝶的準(zhǔn)確鑒定

研究中，DNA條形碼與雄性外生殖器特征相結(jié)合，準(zhǔn)確鑒定了中國(guó)新紀(jì)錄種艾弗斯曼多眼蝶并對(duì)翅面特征進(jìn)行完整描述。胡曉雯、劉德星等[20-21]利用DNA條形碼技術(shù)與外生殖器特征鑒定相結(jié)合分別對(duì)8種蛾類和國(guó)內(nèi)新紀(jì)錄種澳洲麻蠅(Sarcophagaaustralis)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。與前人不同，研究中對(duì)物種成蟲翅面特征進(jìn)行了描述，一方面豐富了艾弗斯曼多眼蝶的紀(jì)錄情況，另一方面也對(duì)今后學(xué)者對(duì)艾弗斯曼多眼蝶的研究奠定基礎(chǔ)提供便利。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)多眼蝶屬的研究極少，而關(guān)于艾弗斯曼多眼蝶，僅有Vladimir等[6]在研究隨著地理區(qū)域覆蓋范圍擴(kuò)大DNA條形碼是否仍然是一個(gè)有效的識(shí)別工具時(shí)，選擇了艾弗斯曼多眼蝶作為研究對(duì)象之一，并將艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。研究中得到的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與Vladimir的結(jié)果比對(duì)相吻合，豐富了國(guó)內(nèi)艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼記錄信息。

在對(duì)艾弗斯曼多眼蝶雄性外生殖器進(jìn)行解剖過程中，易對(duì)外生殖器官結(jié)構(gòu)造成損傷，但可以直觀展現(xiàn)其雄性外生殖器結(jié)構(gòu)，便于描述及研究借鑒引用。利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行鑒定，試驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單方便，對(duì)于標(biāo)本完整度的要求小于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類，效率高，結(jié)果準(zhǔn)確性高。結(jié)合翅面特征的描述，準(zhǔn)確的對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行描述鑒定，彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)關(guān)于該物種記錄的空白，同時(shí)在形態(tài)及分子鑒定層面給出鑒定依據(jù)。

3.2 DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

DNA條形碼技術(shù)在鱗翅目昆蟲的分類鑒定過程中運(yùn)用最為廣泛。國(guó)內(nèi)外關(guān)于鱗翅目昆蟲DNA條形碼的研究，極大的推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，使其逐步成為高效的物種鑒定工具。在研究中，基于艾弗斯曼多眼蝶線粒體COI基因與NCBI中已記錄的基因序列對(duì)比結(jié)果，結(jié)合近年來在物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)研究，相較于DNA條形碼技術(shù)剛提出時(shí)引起的爭(zhēng)議，在今天該技術(shù)已取得了較好的效果。但目前已登錄至GenBank系統(tǒng)中用于鑒定的COI序列有限，也為該技術(shù)帶來了一定的局限性。已有研究嘗試將ITS、Cytb等多基因片段用于DNA條形碼鑒定中，并取得較好效果。黃蓬英等[22]利用ITS1和ITS2序列成功對(duì)刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)進(jìn)行快速分子鑒定；王利華等[23]利用COI與Cytb基因片段對(duì)6種鲌屬魚類進(jìn)行有效區(qū)分，COI序列和Cytb序列相結(jié)合進(jìn)行物種鑒定的可行性；陳光輝[24]利用ITS1、ITS2、Cytb、COI、COII5種基因片段成功鑒定玉米象Sitophiluszeamais。同時(shí)DNA條形碼技術(shù)在物種的不同發(fā)育階段的基因條形碼識(shí)別、物種的系統(tǒng)發(fā)育分析等方面也有很大的研究前景。陳珊等[25]選取巨癤蝙蛾(Endoclitadavidi)的成蟲、卵、幼蟲、蛹不同時(shí)期的COI基因片段進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，并選取NCBI 中記錄的6 種蝙蝠蛾科蛾類以鄰接法(neighbor-joining，NJ)和最大簡(jiǎn)約法(maximumparsimony，MP)2種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果均一致。

形態(tài)學(xué)鑒定過程中對(duì)分類學(xué)家的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)依賴性很強(qiáng)，對(duì)標(biāo)本外部形態(tài)特征的完整性要求很高，而DNA條形碼技術(shù)操作簡(jiǎn)單高效，這便使得形態(tài)學(xué)發(fā)展面臨巨大挑戰(zhàn)。雖然DNA條形碼技術(shù)相較于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在較多優(yōu)點(diǎn)并且有一定的應(yīng)用前景[26]，但其并不能取代傳統(tǒng)分類方法，在分類鑒定中，仍需綜合形態(tài)學(xué)特征來確保鑒定的準(zhǔn)確性，二者相輔相成，保持相互補(bǔ)充的關(guān)系。通過DNA條形碼技術(shù)可以直接鑒定至種級(jí)水平，但單純依據(jù)分子鑒定仍存有局限性，有些物種進(jìn)化時(shí)間較短，表現(xiàn)出較小的種間遺傳距離以及物種基因雜交等情況均會(huì)出現(xiàn)，實(shí)際鑒定中，不能僅僅依據(jù)分子數(shù)據(jù)，脫離形態(tài)學(xué)鑒定的復(fù)核確認(rèn)[27,28]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定作為昆蟲鑒定的經(jīng)典方法仍不失為在物種鑒定過程中的重要手段之一，在集形態(tài)分子為一體的整合分類法也會(huì)使得物種鑒定更為科學(xué)和準(zhǔn)確。

4 結(jié) 論

獲得的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已記錄物種Kiriniaeversmanni對(duì)比，二者為同一物種。在DNA條形碼技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合艾弗斯曼多眼蝶翅面特征及雄外生殖器的形態(tài)描述，對(duì)艾弗斯曼多眼蝶進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定，確定其為中國(guó)新紀(jì)錄種。