番茄microRNA調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)的研究進(jìn)展

李 寧，王 娟，王柏柯，戴 麒，黃少勇，帕提古麗，高 杰，余慶輝

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830042)

0 引 言

【研究意義】植物在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中，伴隨著基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯后水平通過(guò)不同的機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。近年來(lái)，在轉(zhuǎn)錄水平上的基因調(diào)控得到了很好的研究，植物microRNAs引起廣泛關(guān)注[1]。番茄miRNAs在生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境的研究，有助于進(jìn)一步解析番茄在不同逆境脅迫下基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為番茄育種提供新的基因資源，奠定更為完善的理論基礎(chǔ)。為尋求番茄品質(zhì)和產(chǎn)量之間最佳平衡，將來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)圍繞miRNAs及其靶基因?qū)Ψ训恼{(diào)控機(jī)制，盡早明確調(diào)控抗逆和發(fā)育的相關(guān)靶基因，并進(jìn)行克隆功能驗(yàn)證，定向改變番茄果實(shí)品質(zhì)及生長(zhǎng)周期，為番茄耐逆高產(chǎn)新品種的分子育種和品種改良提供新方案?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNAs(microRNAs)是一類在植物和動(dòng)物基因組中自然發(fā)生、高度保守且短小的非編碼RNA分子。植物miRNAs是一類長(zhǎng)度為20～24 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA[2]，通過(guò)對(duì)靶基因(mRNA)的降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因的表達(dá)，參與包括生長(zhǎng)發(fā)育、轉(zhuǎn)座子沉默、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)脅迫應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[3]。番茄(Solanumlycopersicum)不僅是研究肉質(zhì)果實(shí)成熟的模式植物，又是我國(guó)重要的出口優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品之一[4]，位居蔬菜單項(xiàng)產(chǎn)品出口第2位，僅番茄醬年均出口量約占世界貿(mào)易量的1/3[5]。研究影響番茄在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同的逆境脅迫，對(duì)提升番茄風(fēng)味和品質(zhì)有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前，隨著研究的不斷深入，檢索總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)miRNAs起源、作用機(jī)制，調(diào)控番茄生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫的研究進(jìn)展[6]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集相關(guān)文獻(xiàn)、官網(wǎng)等資料，包括miRNAs的合成、作用機(jī)制及相關(guān)網(wǎng)站，分析番茄miRNAs在生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)脅迫過(guò)程中的功能，對(duì)加快番茄品種的分子育種和改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

收集查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料、相關(guān)網(wǎng)站和番茄轉(zhuǎn)錄組的前沿研究進(jìn)展。

1.2 方 法

整理匯總并對(duì)比分析番茄miRNAs研究數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA的合成及作用機(jī)制

2.1.1 植物miRNA的合成

miRNA通常位于基因區(qū)間，但也會(huì)位于基因內(nèi)含子的正義或反義鏈上。在細(xì)胞核中由RNA聚合酶II(Pol-II)轉(zhuǎn)錄，初級(jí)轉(zhuǎn)錄為具有“7-甲基鳥嘌呤核苷酸”帽子(m7GpppN)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA[7-8]。隨后Dicer同源物DCL1(DICER-LIKE酶)對(duì)其實(shí)施2次切割，先后生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA以及miRNA/雙體結(jié)構(gòu)，隨后miRNA/miRNA*(miRNA*為miRNA的互補(bǔ)序列)的3’末端會(huì)被甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1(HUAenhancer1)進(jìn)行甲基化[9-10]。Pre-miRNA在HASTY(Exportin 5在植物中的同源蛋白)的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中[11]。

在細(xì)胞質(zhì)中，雙鏈復(fù)合物中miRNA與AGO(Argonaute)蛋白質(zhì)結(jié)合成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，進(jìn)而指導(dǎo)AGO對(duì)互補(bǔ)靶基因的mRNA進(jìn)行切割，從而抑制靶基因的表達(dá)[12-13]。RISC加載后，miRNA/miRNA*雙螺旋主要由AGO蛋白解旋[14]。雙鏈中miRNA*直接脫離被迅速降解，另一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中，并結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過(guò)堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)[15]。

2.1.2 植物miRNA的作用機(jī)制

miRNA對(duì)基因的調(diào)控是通過(guò)構(gòu)成RISC來(lái)進(jìn)行的，RISC是其調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)，AGO蛋白是RISC復(fù)合體中的核心蛋白。miRNA-RISC識(shí)別mRNA，通過(guò)靶標(biāo)切割或翻譯抑制，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，miRNA-RISC對(duì)靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度[15]。在植物中最為常見的方式是假設(shè)miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)完全互補(bǔ)，將會(huì)引起目的基因mRNA在互補(bǔ)區(qū)的特異性斷裂，最終導(dǎo)致基因沉默[16]。其作用方式是通過(guò)miRNAs的5’端殘基識(shí)別并和靶基因mRNA的開放讀碼框(open reading frame，ORF)互補(bǔ)配對(duì)切割，主要在mRNA的第10/11個(gè)堿基間進(jìn)行切割，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)降解因子(XRN4)催化降解，最終使靶向mRNA無(wú)法翻譯[17]。

第2種是抑制靶基因翻譯，當(dāng)成熟miRNA與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)不完全互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而mRNA的翻譯受到抑制，但不影響mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄，miRNA將通過(guò)翻譯抑制的方式來(lái)調(diào)控靶基因；并且對(duì)靶基因翻譯的抑制可能需要多種miRNA分子的協(xié)同作用，miRNAs與靶基因存在著反饋抑制調(diào)節(jié)途徑[18-19]。

2.1.3 miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)

目前miRNAs的數(shù)據(jù)庫(kù)日漸豐富，高通量測(cè)序的出現(xiàn)有助于植物miRNAs的數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，不僅可以識(shí)別大量miRNAs，而且通過(guò)生物信息學(xué)和試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合為預(yù)測(cè)鑒定植物miRNAs功能注釋提供大量可靠數(shù)據(jù)[16，20]。PMTED是1個(gè)植物特異性miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)在大量現(xiàn)有微陣列數(shù)據(jù)中推斷miRNAs的靶基因表達(dá)譜，從而研究miRNAs功能。PMRD數(shù)據(jù)庫(kù)包含了來(lái)自120種模式植物以及主要農(nóng)作物的8 400多個(gè)miRNAs條目，包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycienemax)和玉米(Zeamays)等幾百種植物的miRNA，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程[21]。表1

表1 部分植物相關(guān)miRNAs計(jì)算工具和數(shù)據(jù)庫(kù)Table 1 Computational tools and databases of some plant-related microRNAs

2.2 miRNAs在番茄生長(zhǎng)發(fā)育的作用

miRNA在番茄生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用，當(dāng)番茄過(guò)表達(dá)miR171時(shí)，通過(guò)抑制靶基因GRAS基因家族(SLGRAS24)，導(dǎo)致番茄植株變大。缺氧處理后，野生番茄的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變推測(cè)是生長(zhǎng)素穩(wěn)態(tài)相關(guān)的miR159、miR171和miR396表達(dá)差異所導(dǎo)致[22]。番茄miR167在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)中的具有進(jìn)化保守作用，其上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致靶基因生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factor，ARF6/8)的表達(dá)下降，從而影響生長(zhǎng)素信號(hào)通路[23]。番茄通過(guò)SlARF10調(diào)節(jié)氣孔孔徑來(lái)減少水分損失，維持葉片水分平衡，Sl-miR160通過(guò)對(duì)SlARF10的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，增加了脫落酸(abscisic acid，ABA)合成信號(hào)響應(yīng)，從而保證植物正常發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)[24]。

番茄花梗脫落過(guò)程中，乙烯能夠影響miRNA的表達(dá)和調(diào)控，最終促進(jìn)花梗脫落。在脫落過(guò)程中，乙烯可以介導(dǎo)miR160和miR167的表達(dá)，二者是生長(zhǎng)素信號(hào)的重要介質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR172在花梗脫落過(guò)程中表達(dá)顯著升高，靶基因APETALA2乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(AP2c)上調(diào)，而乙烯負(fù)調(diào)控miR172的表達(dá)[25]。番茄7B-1是一種光周期敏感的雄性不育突變體，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑MYB轉(zhuǎn)錄因子(gibberellin- and abscisic acid-regulated MYB，GAMYB1)的表達(dá)與7B-1花藥發(fā)育和莖中的miR159水平呈負(fù)相關(guān)，miR396在7B-1花藥和莖中促進(jìn)胱抑素(cystatin)的分裂，miR159-GAMYB1和miR396-cystatin級(jí)聯(lián)反應(yīng)與7B-1的小孢子和花藥發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[26]。miRNA159/GAMYB1/2對(duì)番茄胚珠發(fā)育和果實(shí)發(fā)育至關(guān)重要。過(guò)表達(dá)SlmiR159的番茄，其植株表現(xiàn)果實(shí)早熟與單性結(jié)實(shí)，但果實(shí)形狀未發(fā)生改變。此外，在轉(zhuǎn)基因株系中SlGAMYB1/2能夠?qū)е屡c胚珠、雌配子體發(fā)育和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)[27]。

在番茄gib-3突變體中，miRNA160、miRNA167及其靶點(diǎn)可能參與頂端分生組織的細(xì)胞分裂，miRNA調(diào)控的SlARF6、SlARF8、SlARF10和SlARF16的表達(dá)與果皮細(xì)胞層發(fā)育呈負(fù)相關(guān)，由此推論ARFs表達(dá)水平的升高可能是生殖細(xì)胞分裂終止的主要因素[28]。在番茄生長(zhǎng)過(guò)程中，過(guò)表達(dá)miR164能夠影響番茄植株形態(tài)及果實(shí)單個(gè)發(fā)育階段的必需時(shí)間。將來(lái)miR164可用于改善重要品種的農(nóng)藝性狀[29]。番茄Sly-miR1917通過(guò)調(diào)節(jié)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SlCTR4)剪接變異體SlCTR4sv(乙烯信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)器)的表達(dá)參與植物乙烯反應(yīng)，過(guò)表達(dá)Sly-miR1917增強(qiáng)了乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的上調(diào)，并加快花梗脫落和果實(shí)成熟[30]，與miR172促進(jìn)花梗脫落功能相似。乙烯參與了番茄果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中miRNA積累調(diào)控。Sly-miR157在正常番茄果實(shí)和果實(shí)無(wú)色不成熟突變體(Colourless non-ripening，Cnr)中調(diào)節(jié)關(guān)鍵成熟基因SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(SQUAMOSA promoter-bindinglike，SPL)LeSPL-CNR的表達(dá)。LeSPL-CNR可能影響LeMADS-RIN、LeHB1、SlAP2a和SlTAGL1的表達(dá)，在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中，Sly-miR156不影響果實(shí)成熟，SlymiR157和SlymiR156形成一種附加關(guān)鍵調(diào)控層，影響紅熟期果實(shí)的軟化[31]。RIN通過(guò)結(jié)合其啟動(dòng)子區(qū)域直接抑制miR172a轉(zhuǎn)錄，并影響miR172的積累[32]。

2.3 miRNAs對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)

2.3.1 miRNAs與干旱脅迫

干旱是制約全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素，據(jù)估計(jì)每年全球一半農(nóng)作物受干旱脅迫，超過(guò)其他逆境脅迫造成損失的總和[33]。眾所周知對(duì)植物耐旱性的基礎(chǔ)研究已經(jīng)確定了許多干旱脅迫相關(guān)的抗性基因，過(guò)表達(dá)這些脅迫響應(yīng)基因能夠提高植物的應(yīng)激耐受性。然而除了蛋白質(zhì)編碼基因外，植物中的miRNAs在應(yīng)激條件下的表達(dá)也發(fā)生了變化，研究表明miRNAs介導(dǎo)的植物脅迫響應(yīng)是通過(guò)調(diào)控靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，值得注意的是，越來(lái)越多的研究表明，miRNAs在植物耐旱性和抗旱性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于干旱脅迫下番茄中miRNAs及其靶點(diǎn)的信息仍然非常有限[34]。

Liu等發(fā)現(xiàn)野生番茄潘那利漸滲系IL9-1在干旱脅迫下，sly-miR6024、sly-miR1009和其對(duì)應(yīng)靶基因(solyc06g72130、solyc12g099800)顯著上調(diào)，一些保守的miRNAs在番茄中也首次被鑒定為對(duì)干旱有反應(yīng)，如sly-miR1919、sly-miR5300和sly-miR9477。[35]。此外，miR156、miR169、miR172和miR319在擬南芥、水稻和小麥中受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，而且這些miRNAs在番茄中同樣受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[36]。野生番茄潘那利漸滲系IL2-5在干旱處理后，sly-miR166c-5p和sly-miR-429表達(dá)明顯下調(diào)，相應(yīng)的靶基因solyc03g02340和solyc01g08980在應(yīng)激后表達(dá)顯著升高。番茄漸滲系IL2-5干旱脅迫后，Sly-miR716下調(diào)表達(dá)，其靶基為膜聯(lián)蛋白(Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V)，該蛋白在植物抗逆境和發(fā)育中起著重要作用[37]。

miR165、miR166、miR398、miR9472、miR9476和miR9552都是參與番茄響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵性miRNA。其中miR9552表現(xiàn)出對(duì)干旱、組織和基因型特異性，sly-miR9552a-3p僅在敏感基因型番茄根部表達(dá)。miR9552的靶基因是UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)，抑制其表達(dá)將會(huì)增加根中UGT水平，從而降低敏感基因型的抗旱性[38]。

過(guò)表達(dá)miR1916的轉(zhuǎn)基因番茄植株對(duì)干旱響應(yīng)敏感，是通過(guò)降低滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除的途徑進(jìn)行調(diào)控。miR1916的潛在靶基因是編碼富含羥脯氨酸糖蛋白家族蛋白的SGN-U376418 mRNAs。與野生型相比，葉綠素含量的增加有助于增強(qiáng)miR1916轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性。miR1916在不同干旱脅迫時(shí)期的表達(dá)水平可能不同，是番茄抗旱性的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)茄科植物的非生物脅迫反應(yīng)具有潛在的影響[39]。

2.3.2 miRNAs與鹽脅迫

土壤鹽堿是限制作物生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一。目前轉(zhuǎn)基因耐鹽植物表現(xiàn)不理想，主要是復(fù)雜的遺傳機(jī)制導(dǎo)致[34]。目前，非編碼RNA中如miRNAs正迅速成為解碼植物應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因調(diào)控的有效平臺(tái)。響應(yīng)鹽脅迫植物miRNAs不斷地被發(fā)現(xiàn)，其作用于靶基因并通過(guò)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育等生物功能抵御外界鹽脅迫危害[40]。

在醋栗番茄受鹽脅迫誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)3種新型miRNAs(sly-miRn7c-2、sly-miRn86a-1和sly-miRn97a)，但在鹽處理的栽培番茄M82中受到抑制表達(dá)。sly-miR160a、sly-miR166b、sly-miR166c-5p、sly-miR169a和sly-miR9470-5p是野生醋栗番茄特有的耐鹽相關(guān)miRNAs，sly-miR482e-5p潛在的靶基因編碼應(yīng)激相關(guān)的GRAS轉(zhuǎn)錄因子、CBF轉(zhuǎn)錄因子、F-box，推測(cè)sly-miR482e-5p在番茄耐鹽性中起關(guān)鍵作用。參與醋栗番茄耐鹽過(guò)程的sly-miRn50a，其靶基因參與角質(zhì)層、亞嘌呤和蠟質(zhì)層的生物合成，這種途徑可以通過(guò)減少蒸發(fā)來(lái)提高植物對(duì)鹽和干旱脅迫的適應(yīng)性[41]。

2.3.3 miRNAs與溫度脅迫

隨著全球氣候變化，高溫正在成為限制番茄產(chǎn)量的一個(gè)日益嚴(yán)重的因素。營(yíng)養(yǎng)期和生殖期受到熱脅迫的不利影響，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)下降。與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)相比，高溫脅迫對(duì)番茄生殖生長(zhǎng)的影響更大，番茄耐熱性基因型間存在廣泛的變異性。而低溫通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)水的結(jié)晶導(dǎo)致細(xì)胞和組織脫水，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[6]。

在番茄生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中，成熟的miR167a與前體miR167a的表達(dá)模式呈現(xiàn)出相反模式[42]。在高溫條件下，番茄植株通常表現(xiàn)出柱頭外露的表型，嚴(yán)重阻礙番茄自花授粉和結(jié)實(shí)，miR398b-3p/SLCSD1、miR393-5p/SLTIR1、miR160a/SLRF10/16、miR156e-5p/SLSPL15和miR397-5p/LACs這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與響應(yīng)熱激應(yīng)答調(diào)控，例如雌雄蕊的代謝途徑。生長(zhǎng)素信號(hào)介導(dǎo)的miR393-5p/SLTIR1和miR160a/SLARF10/16級(jí)聯(lián)反應(yīng)被高溫處理后激活，調(diào)控雄蕊發(fā)育[43]。

野生番茄醋栗在低溫和中溫中均能誘導(dǎo)miR156和miR396的表達(dá)，并抑制miR168在番茄植株中的表達(dá)。耐熱醋栗番茄中調(diào)節(jié)碳固定的基因相關(guān)miRNA有助于維持高溫下葉片的正常生理活動(dòng)，從而增強(qiáng)耐熱性。在高溫脅迫下，spi-miR6300_gma，其靶基因?yàn)闊峒さ鞍?heat-shock proteins，hsp70)，而spi-miR166c-3p和spi-miR166g-3p_osa的靶基因?yàn)閔sp60-3A，這些miRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)熱休克蛋白在植物對(duì)高溫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[44]。

可變剪接和miRNA差異表達(dá)是導(dǎo)致野生多毛番茄和栽培番茄品種間耐寒性差異的重要原因。miR159、miR319潛在靶基因均為MYB65，miR6022靶基因是擬南芥同源盒亮氨酸拉鏈蛋白(Arabidopsis thaliana Homeobox-leucine zipper protein，ATHB13)，這3個(gè)非生物應(yīng)激級(jí)聯(lián)在低溫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。野生多毛番茄MiR319家族成員的表達(dá)與番茄的耐冷性呈正相關(guān)[45]。在熱應(yīng)激的初始階段，miR319a、miR319b和miR319d對(duì)TCP3、TCP29和TCP2有調(diào)節(jié)作用，miR319a和miR319b啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBSI，這表明miR319與TCP3和TCP29參與了由活性氧(ROS)和Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)和花青素合成引起的溫度應(yīng)激調(diào)節(jié)反應(yīng)[46]。在冷脅迫或熱脅迫下，過(guò)表達(dá)sha-miR319d野生多毛番茄植株抵抗應(yīng)激能力明顯增強(qiáng)，并且超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性升高，表明sha-miR319d可能通過(guò)抑制GAMYB-like1的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)番茄的耐冷性，并進(jìn)一步增強(qiáng)抗寒、耐熱和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[47]。

2.3.4 miRNAs對(duì)生物脅迫的響應(yīng)

隨著番茄疫霉對(duì)番茄生產(chǎn)的威脅越來(lái)越大，解析番茄疫霉抗性機(jī)制日益迫切。植物具有一系列特定的抗病原體(R)基因，miR482/2118能夠調(diào)節(jié)R基因的表達(dá)，即含有富氨酸重復(fù)區(qū)和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS-LRRS)。在番茄感染疫霉病初期和后期由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中，成熟Sly-miR482/2118及其靶基因的共調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)并具有時(shí)間依賴性[48]。通過(guò)短串聯(lián)靶標(biāo)模擬技術(shù)(STTM)沉默miR482b，隨著miR482b含量降低，植株對(duì)侵染疫霉病的抗性顯著增強(qiáng)，miR482b的RNAi植株中，NBS-LRR的表達(dá)增強(qiáng)使番茄對(duì)疫霉病的抗性增強(qiáng)，表明了miR482b-NBS-LRR是番茄-感染疫霉病相互作用網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要組成部分[49]。

過(guò)表達(dá)Sly-miR1916的番茄植株對(duì)疫霉病和灰霉病感染的敏感性顯著增強(qiáng)?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)α-托馬汀和花青素來(lái)調(diào)節(jié)番茄植株中STR-2、UGT和MYB12的表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)生物脅迫的敏感性[50]。miR172家族通過(guò)調(diào)節(jié)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)參與逆境脅迫。過(guò)表達(dá)miR172a的轉(zhuǎn)基因番茄中具有更大的抵抗感染性，miR172-AP2/ERF級(jí)聯(lián)可以調(diào)節(jié)抗氧化劑，減少ROS的積累，防止感染后細(xì)胞膜損傷[51]。過(guò)表達(dá)pi-miR1918的番茄植株在感染疫霉病后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的疾病癥狀，其靶基因sly-TG2的表達(dá)與miR1918的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明可能參與了靶基因的沉默，從而增強(qiáng)番茄對(duì)疫霉病的易感性[52]。

番茄枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici，F(xiàn)OL)是一種危害番茄的全球性病害。番茄根在FOL感染下，sly-miR160a和new_mir_762靶向基因分別是生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(Auxin response factors 10B、16A、16B、17、10A)和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的IAA(Auxin-regulated IAA7)，生長(zhǎng)素不僅是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫的重要植物激素，而且是一種新的降低病原菌毒力的功能分子。在植物-病原相互作用途徑中，驗(yàn)證了9個(gè)抗病相關(guān)差異表達(dá)基因包括SLWRKY40/41、受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、致病相關(guān)蛋白、類鈣調(diào)素蛋白、鈣結(jié)合EF-hand家族蛋白和環(huán)核苷酸門控通道[53]。煙草花葉病毒(TMV)侵染番茄后，6個(gè)miRNA家族13個(gè)miRNA表達(dá)水平的變化。TMV感染也會(huì)導(dǎo)致miR166c5p和miR319c-5p的快速誘導(dǎo)和高水平的積累。在TMV感染的番茄葉片上觀察到的卷曲變形可能是由于miR159和miR166水平的改變。病毒侵染后，miR159和miR166在TMV侵染的番茄葉片中大量積累。miR159的靶點(diǎn)是在葉片發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了良好作用的MYB-TFs，miR166靶向同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(HD-ZIP-TF)家族，該家族對(duì)葉片發(fā)育也很重要[54]。

為進(jìn)一步研究miRNA介導(dǎo)的植物-昆蟲相互作用機(jī)制，對(duì)敏感型栽培番茄和抗性多毛番茄在感染煙粉虱后不同階段的miRNAs進(jìn)行了鑒定，共鑒定出44個(gè)已知miRNA家族，其中33個(gè)是2個(gè)物種共有，其中有13個(gè)新miRNA家族。miR168的唯一靶基因是AGO1，它是miRNA或siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑的核心成分。病毒誘導(dǎo)顯著改變了AGO1(argonaute1)和miR168的表達(dá)水平，表明它們可能在應(yīng)對(duì)生物脅迫中發(fā)揮作用。miR167靶向多重耐藥相關(guān)蛋白和膜聯(lián)蛋白基因。前者在植物中不僅參與植物解毒，而且還參與細(xì)胞壁通透性。膜聯(lián)蛋白在抗逆和植物發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。番茄miR397的靶基因是一個(gè)屬于多酚氧化酶類的lac酶，其功能主要與傷害、外界脅迫、食草動(dòng)物或病原菌攻擊有關(guān)[55]。

3 討 論

miRNA是一類進(jìn)化上保守的、具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA。miRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式靶向mRNA，將其降解或抑制翻譯，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因。自21世紀(jì)初首次報(bào)道植物miRNA以來(lái)，植物miRNA的相關(guān)研究有了顯著的增長(zhǎng)，在植物中，miRNA幾乎在所有的生物學(xué)過(guò)程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用，特別是對(duì)一些重要的農(nóng)藝性狀的精細(xì)調(diào)控使其可以作為品種選育或改良的重要對(duì)象。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)及表型組學(xué)的發(fā)展，miRNA被證明能夠調(diào)節(jié)各種應(yīng)激反應(yīng)的基因、蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子，參與在逆境條件下維持生物應(yīng)激耐受過(guò)程[56]。盡管一些作物如水稻、番茄、玉米、大豆、煙草等全基因組序列已經(jīng)完成，但與生物(病毒、細(xì)菌和真菌感染)和非生物(鹽度、營(yíng)養(yǎng)缺乏、重金屬)相關(guān)的miRNAs并沒(méi)有完全注釋[6]。尤其是在復(fù)合脅迫條件下，植物miRNAs及其靶基因?qū)γ{迫的調(diào)控機(jī)制成為植物科學(xué)研究的重要領(lǐng)域。

利用高通量方法和生物信息學(xué)工具，可以識(shí)別出新的miRNAs及其靶基因，含有miRNAs或其靶基因的轉(zhuǎn)基因作物植株對(duì)非生物脅迫(干旱、鹽分、溫度等)具有一定抗性。miRNA基因調(diào)控是一種新的、可行的提高植物抗逆境能力的方法。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是植物針對(duì)病毒侵染的一個(gè)重要的應(yīng)答反應(yīng)。人工微RNA(artificial miRNA，amiRNA)是一種沉默基因表達(dá)的第2代RNAi技術(shù)[57]，在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)通過(guò)靶向病毒抑制轉(zhuǎn)錄物而產(chǎn)生病毒抗性，因此，amiRNA介導(dǎo)的方法可以為在經(jīng)濟(jì)重要的農(nóng)作物中工程化多病毒抗性提供廣泛的應(yīng)用。隨著miRNAs研究的深入，有望定向改變番茄果實(shí)品質(zhì)及生長(zhǎng)周期，并為番茄逆境抵抗提供新的思路和方法。

4 結(jié) 論

miRNA是一類廣泛存在于植物體內(nèi)，位于基因組非編碼區(qū)長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。番茄諸多生物學(xué)過(guò)程都受到miRNA的調(diào)控，包括植株形態(tài)、器官發(fā)育、生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)干旱、鹽、溫度和生物脅迫等方面。miRNAs在番茄生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答等方面起重要作用，圍繞miRNAs及其靶基因?qū)Ψ训恼{(diào)控機(jī)制，定向改變番茄果實(shí)品質(zhì)及生長(zhǎng)周期。