三種花色君遷子的花粉粒形態(tài)及花粉生活力鑒定

張曉娜,周瑞金,毛樹林,張傳來,扈惠靈

（1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

花粉是植物種質(zhì)的形式之一,是種質(zhì)保存、交換以及雜交育種的重要材料[1].不同植物種類的花粉在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中,經(jīng)過不斷演化和發(fā)展往往形成獨(dú)特的形態(tài)特征,即使是同一種內(nèi)的花粉也存在形態(tài)和生活力上的多樣性[2],但受外界環(huán)境條件的影響較小,具有很強(qiáng)的遺傳保守性和穩(wěn)定性[3-6].因此,花粉形態(tài)在植物分類、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化過程等研究中具有重要的作用,也是植物進(jìn)行遺傳育種的重要依據(jù).

君遷子（Diospyros lotus L.）屬柿樹科、柿屬,又稱軟棗、黑棗,分布極為廣泛,由于其具有較強(qiáng)的耐旱耐寒等抗逆特點(diǎn),成為我國(guó)澀柿和甜柿生產(chǎn)中的主要砧木[7-8],同時(shí)也是優(yōu)良的園林綠化樹種.我國(guó)君遷子種質(zhì)資源非常豐富,為典型的雌雄異株植物,且存在形態(tài)性狀上的多樣性[9-11].目前還沒有一種完整、全面的評(píng)價(jià)體系對(duì)君遷子的種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)與分類.有研究者對(duì)部分柿屬植物的花粉粒進(jìn)行了觀察,并對(duì)花粉外壁表面的紋飾進(jìn)行了描述,為柿屬植物的分類鑒別、親緣關(guān)系鑒定與種質(zhì)創(chuàng)新提供了孢粉學(xué)基礎(chǔ)[6,12].據(jù)課題組研究人員的多年觀察,君遷子的雄株在花色特征方面差異明顯,主要有橙黃色、黃色和玫紅色三種類型,不同的雄花花色在君遷子資源分類鑒別中最易識(shí)別,但花色在雄株資源分類的地位尚不清楚.擬通過對(duì)比三種花色的君遷子花粉粒形態(tài)及生活力差異,研究君遷子花色差異與花粉粒形態(tài)及生活力差異間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究花色在君遷子雄性資源分類和評(píng)價(jià)中的作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河南科技學(xué)院君遷子苗圃,該苗圃收集了河南省太行山、伏牛山、桐柏山三大山區(qū)的君遷子野生資源,為實(shí)生混種苗圃,種子播種育苗后移栽定植,株行距2 m×3 m,株齡5年,土壤為砂壤土.試驗(yàn)選擇苗圃內(nèi)三種花色的有代表性雄株各2株,株號(hào)分別為xx-6、xx-13,xx-20、xx-21,xx-11、xx-24,其中xx-6、xx-13為橙黃色,xx-20、xx-21為黃色,xx-11、xx-24為玫紅色.

1.2 君遷子花粉粒形態(tài)的電鏡觀察

2017年5月,雄花處于大蕾期,從植株的向陽(yáng)面中部枝條上分別收集6株君遷子花粉用于掃描電子顯微鏡觀察.將干燥花粉粘貼于日立S-450掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)的雙面膠紙上,對(duì)供試花粉在掃描電子顯微鏡下選擇典型花粉粒3粒,分別在400倍（群體）、3 000倍（極面）、6 000倍（赤道面）下拍照,觀察花粉的赤道面、極面形態(tài)及赤道面外壁紋飾特點(diǎn),測(cè)量不同單株花粉粒的極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝長(zhǎng).

1.3 君遷子最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選及花粉生活力測(cè)定

用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基.以質(zhì)量濃度6 g/L瓊脂為基本固體培養(yǎng)基,添加質(zhì)量濃度分別為10、15、20 g/L的蔗糖,質(zhì)量濃度分別為10、30、50 mg/L的硼酸,控制pH值分別為5.0、6.0、7.0.將6株君遷子的花粉均勻混合,取適量播于供試培養(yǎng)基上,置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)4 h,在200倍光學(xué)顯微鏡下鏡檢花粉萌發(fā)率,每個(gè)處理觀察3個(gè)視野,每個(gè)視野不少于30粒花粉,以花粉管長(zhǎng)度達(dá)花粉粒直徑長(zhǎng)度為發(fā)芽花粉.

將6株君遷子花粉分別播于已篩選出的最佳培養(yǎng)基上,按上述的培養(yǎng)和觀察方法,測(cè)定不同單株的花粉生活力.

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 三種花色的君遷子花粉粒形態(tài)和大小的差異

君遷子單株花色特征及花粉粒形態(tài)見圖1.

圖1 6株君遷子單株花色特征及花粉粒形態(tài)Fig.1 Floral color and pollen morphology of six Diospyros lotus

在掃描電子顯微鏡下觀察6株君遷子花粉粒形態(tài),均呈現(xiàn)出赤道面觀為長(zhǎng)橢圓形,極面觀均為三裂圓形,三孔萌發(fā)溝深且窄,并延伸至兩極,邊緣規(guī)整.依據(jù)1980年Walker[6]的花粉形態(tài)分類方法,君遷子花粉屬于赤道三溝類型（N3P4C5）,該特征可能是君遷子花粉的穩(wěn)定的共性特征.另外觀察結(jié)果顯示,6株君遷子花粉粒赤道面外壁紋飾有明顯的差異,可分為3類,xx-6和xx-13單株的花粉粒外壁表面有不均勻的點(diǎn)狀凹陷紋飾,花色為橙黃色；xx-21、xx-20單株的花粉粒外壁表面均質(zhì)光滑,沒有紋飾,屬黃色單株；xx-11、xx-24單株的花粉粒外壁表面凹凸不平,有下陷凹跡,屬玫紅色單株.

6株不同花色君遷子的花粉粒極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、極軸/赤道軸比和萌發(fā)溝長(zhǎng)之間存在顯著差異.其分析結(jié)果見表1.

表1三種花色的6株君遷子花粉粒大小的差異Tab.1 Comparison of pollen grainsmorphology indexesfor 6 plantsof three flower colors D.lotus

由表1可知,極軸長(zhǎng)介于41.05～45.97μm,以橙黃色的xx-6、xx-13單株和玫紅色的xx-11單株花粉粒極軸較長(zhǎng),橙黃色的xx-6、xx-13單株間花粉粒極軸長(zhǎng)差異不顯著.赤道軸長(zhǎng)介于21.32～24.18μm,差異較小,黃色的xx-20和xx-21單株間花粉粒赤道軸長(zhǎng)差異不顯著,橙黃色和玫紅色的兩個(gè)單株之間有明顯的差異.萌發(fā)溝長(zhǎng)介于34.21～40.73μm,以黃色的xx-20單株花粉粒萌發(fā)溝最長(zhǎng),而同是黃色的xx-21的萌發(fā)溝長(zhǎng)最短,玫紅色的xx-11、xx24單株的花粉粒萌發(fā)溝長(zhǎng)基本沒有差異.極軸長(zhǎng)與赤道軸長(zhǎng)的比值介于1.72～2.01μm之間,花粉粒呈現(xiàn)橢圓形,不同花色的兩個(gè)單株間P/E均有顯著差異.通過以上分析表明,所觀察的6株君遷子花粉粒的極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、極軸/赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝長(zhǎng)各有不同程度的差異,但與其花色沒有必然聯(lián)系.

2.2 三種花色君遷子花粉生活力的比較

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基,9個(gè)處理組合中以6-A3B1C2培養(yǎng)效果最好,即質(zhì)量濃度為6 g/L瓊脂固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為20 g/L蔗糖、質(zhì)量濃度為10 mg/L硼酸,pH值6.0,正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,混合花粉的萌發(fā)率可達(dá)28.14%,顯著高于其它處理組合.

表2不同處理組合對(duì)混合君遷子花粉生活力的影響Tab.2 Effectsof different treatments on viability of D.lotus mixed pollen

采用篩選出的最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)三種花色的6株君遷子花粉,比較其生活力差異.其分析結(jié)果見表3.

表3三種花色6株君遷子花粉生活力比較Tab.3 Comparison of pollen viability of 6 strainsof D.lotus in threeflower colors

從表3可以看出,6株君遷子花粉的生活力各不相同,且有顯著差異,介于20.52%～87.50%,花色為橙黃色的xx-6、xx-13單株花粉生活力均較低（xx-6為36.52%,xx-13為30.03%）；黃色的xx-20單株和玫紅色的xx-24單株花粉生活力較高,可達(dá)71.05%、87.50%,玫紅色的xx-11單株花粉生活力最低,僅有20.52%.所觀察的6株君遷子花粉生活力間均有顯著差異,表明不同花色的單株間或同一花色的不同單株間花粉生活力差異較大,由此可見,君遷子的花粉生活力與其花色之間沒有必然關(guān)系.

3 討論

花色是植物識(shí)別的主要特征?,也是植物表型分類的主要依據(jù),雖直觀易行,但易受環(huán)境條件的影響,并不能真實(shí)地反映其親緣和演化關(guān)系.君遷子的花粉粒形態(tài)是特種的固有特征,一般認(rèn)為,花粉粒形態(tài)很少受環(huán)境因素的影響而成為穩(wěn)定和保守的性狀,可為物種的親緣關(guān)系鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供可靠的依據(jù)[13].胡超瓊等在對(duì)柿屬植物花粉形態(tài)進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn),17種柿屬植物（包含君遷子）的花粉粒極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)介于0.95～1.44之間,均為近球形或扁球形[12],與張永芳等[6]研究的結(jié)果相似,本試驗(yàn)中所觀察的三種花色的6株君遷子花粉粒為長(zhǎng)球形或橢圓形,極軸長(zhǎng)與赤道軸長(zhǎng)之比介于1.719～2.011之間,與胡超瓊等研究者的研究結(jié)果相差較大,造成這種差異的原因可能有兩個(gè)方面,第一,君遷子野生資源群體龐大,分布范圍較廣,遺傳背景復(fù)雜,不同地域的群體間可能存在比較大的差異,目前還沒有對(duì)所有君遷子進(jìn)行系統(tǒng)的分類研究,本試驗(yàn)君遷子為河南省太行山、伏牛山、桐柏山三大山區(qū)的君遷子實(shí)生混種野生資源,因采樣的君遷子單株地域來源不同,也可能會(huì)造成花粉粒形態(tài)上具有較大的差異.第二,花粉采集觀察的時(shí)間不同,花粉發(fā)育程度不一樣,其形態(tài)也會(huì)有所差異.

花粉粒赤道面外壁的紋飾是利用掃描電子顯微鏡可直觀的花粉粒特征,其差異是不同資源的遺傳特征[6,12].本研究表明君遷子不同單株花粉粒赤道面外壁的紋飾差異和雄花花色的差異密切相關(guān),這一特征可作為君遷子資源分類和鑒定的孢粉學(xué)依據(jù).雖然不同雄性單株君遷子花粉粒的其他特征如極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、極軸/赤道軸比和萌發(fā)溝長(zhǎng),以及花粉生活力的大小也是不同單株所特有的遺傳特征,但本試驗(yàn)表明這些特征與花色沒有必然聯(lián)系,這些特征不足以作為君遷子資源的花色分類依據(jù),可進(jìn)一步借助花器官形態(tài)特征如花冠大小、花藥顏色、花絲情況等對(duì)君遷子資源進(jìn)行更為準(zhǔn)確的分類.

4 結(jié)論

三種花色的君遷子花粉粒均為長(zhǎng)球形（橢圓形）,極面觀為三裂圓形,具三孔萌發(fā)溝；同一花色的君遷子花粉粒赤道面外壁的紋飾相似,不同花色的君遷子花粉粒赤道面外壁的紋飾存在明顯差異；君遷子花粉粒的極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、極軸/赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝長(zhǎng)各有不同程度的差異,但與其花色沒有必然聯(lián)系.