原料乳中嗜冷菌菌群多樣性及分析方法研究進(jìn)展

吳天賜，張娟，李楠

（1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200444；2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海200436）

0 引 言

優(yōu)質(zhì)的原料乳是保證乳制品質(zhì)量的重要因素，隨著冷鏈技術(shù)的不斷完善，嗜溫細(xì)菌對原料乳的污染和質(zhì)量破壞已經(jīng)得到了一定程度的解決,但仍無法有效控制低溫下能夠生長繁殖的嗜冷菌。嗜冷菌在低于5℃環(huán)境下也能生長繁殖，是在原料乳儲藏、運(yùn)輸和生產(chǎn)過程中需要控制的主要菌群之一[1]。嗜冷菌主要分為兩類微生物，其一為專性嗜冷菌（Psychrophiles），其二為兼性嗜冷菌（Psychrotrophics）,后者是目前原料乳中主要活躍的嗜冷菌。國際乳品聯(lián)合會（International Dairy Federation）所規(guī)定的嗜冷菌為：在20℃以下能夠生長繁殖，且最適生長溫度在10~15℃的一類微生物[2

]。

正因?yàn)槭壤渚N類繁多，目前仍然只能一次對其中少部分嗜冷菌進(jìn)行特異性快速檢測，并且檢測結(jié)果存在“假陽性”的情況，導(dǎo)致檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確[3-4]。不同地區(qū)的原料乳樣品中嗜冷菌優(yōu)勢菌群也不盡相同，這使得快檢技術(shù)無法對原料乳中嗜冷菌進(jìn)行全面檢測。在運(yùn)輸儲藏期間嗜冷菌不斷產(chǎn)生無法通過巴氏滅菌和超高溫滅菌完全去除的耐高溫蛋白酶和耐高溫脂肪酶，導(dǎo)致乳制品在貨架期內(nèi)出現(xiàn)結(jié)塊、變苦、凝乳等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響乳制品品質(zhì)[5]。

分析掌握原料乳中優(yōu)勢菌群是建立具有普遍性、針對性檢測和控制技術(shù)的前提。本文綜述了目前原料乳中嗜冷菌的菌群多樣性影響因素、可能來源和原料乳嗜冷菌菌群分析常用的方法技術(shù)。

1 原料乳中嗜冷菌多樣性影響因素

原料乳中嗜冷菌主要包括γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）以及占比不高的α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）、黃桿菌綱（Flavobacteria）和鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria），每個綱有20個左右菌種[6]。Nuwan等人[7]總共分離鑒定了927株菌株，其中19.9%為假單胞菌屬，13.3%為芽孢桿菌屬，5.3%為微桿菌屬，8.6%為乳球菌屬，4.9%為不動桿菌屬，2.8%為哈夫尼菌屬，還有相當(dāng)大一部分菌為迄今未知的種屬。2017年，Yuan等人[8]從中國11個城市的不同牧場采集的原料乳中分離鑒定了480株菌株，歸屬于24個屬和74個種，所有分離菌株中假單胞菌屬最多，占比58.8%，其次為不動桿菌屬、黃桿菌屬和鞘脂桿菌屬，分別占比為13.3%、6.0%、4.2%，其中包括了12.3%的菌株是未知的。來源不同的原料乳樣品中嗜冷菌菌群結(jié)構(gòu)存在著一定的差異，其多樣性主要受到溫度、儲藏時(shí)間、氣候、地域和季節(jié)等因素影響。

1.1 儲藏溫度和儲藏時(shí)間因素

原料乳中嗜冷菌大部分屬于兼性嗜冷菌，其最適生長溫度高于15℃，在4~12℃之間溫度越高則越有利于原料乳中的嗜冷菌生長[9]。所以在原料乳運(yùn)輸、儲藏階段，如果沒有控制好合適的溫度，嗜冷菌便會大量生長繁殖產(chǎn)生水解酶進(jìn)而破壞原料乳的品質(zhì)。目前我國冷鏈運(yùn)輸?shù)募夹g(shù)并沒有達(dá)到非常成熟的階段，并非所有牧場都能保證原料乳的運(yùn)輸、裝罐時(shí)將溫度控制在6℃，以及將牧場儲奶罐控制在3.5℃[10]。

Paludetti等人[11]發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛奶在2℃下儲藏96 h后，嗜冷菌的數(shù)量從4.34 log CFU/mL增加到了6.44 log CFU/mL，在4℃下儲藏72 h后，嗜冷菌的數(shù)量則更多，與前者相比存在顯著性差異。盡管這些變化不至于對牛奶成分和加工參數(shù)產(chǎn)生明顯的影響，但仍說明溫度和儲藏時(shí)間對嗜冷菌菌群有著極大的影響。Karlsson等人[12]的研究報(bào)道，UHT乳在4℃和20℃條件下保質(zhì)期可達(dá)到34~36周，然而在30℃和37℃條件下保質(zhì)期則會縮短至16~20周，并且有明顯的沉淀形成以及口感和色澤的變化。Ribeiro等[13]分析巴西地區(qū)原料乳，發(fā)現(xiàn)樣品中平均嗜冷菌數(shù)量為1.1×104CFU/mL，并且存在大量具有產(chǎn)蛋白水解酶能力的菌株，其中乳酸乳球菌、神戶腸桿菌、解脲沙雷氏菌、尿氣球菌和地衣芽孢桿菌的豐度較高，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，47.8%和29.8%的分離菌株分別在35℃下48 h內(nèi)和7℃下10 d內(nèi)出現(xiàn)了腐敗能力。所以應(yīng)當(dāng)盡量減少原料乳儲藏時(shí)間，盡快進(jìn)行滅菌處理，防止嗜冷菌產(chǎn)生大量水解酶而破壞原料乳品質(zhì)。

1.2 地域因素

不同地區(qū)的環(huán)境中相對濕度、溫度和光照條件并不相同，而且各個牧場的管理?xiàng)l件和方式不一樣，原料乳中的微生物大多來自外界環(huán)境，因此不同地區(qū)的原料乳中嗜冷菌菌群也存在一定的差異。

李建洲等人[14]通過對新疆烏昌地區(qū)和喀什地區(qū)的多個牧場環(huán)境研究分析，發(fā)現(xiàn)兩地區(qū)環(huán)境中嗜冷菌種類存在明顯差異，在臥床土、飼料、空氣和管道口中，嗜冷菌種類豐度在烏昌地區(qū)顯著高于喀什地區(qū)，在乳牛乳頭部位、奶罐口和混奶中，嗜冷菌種類豐度則是喀什地區(qū)顯著高于烏昌地區(qū)。2016年，Liang等人[15]利用PCR-DGGE技術(shù)分析了中國北部3個地區(qū)的原料乳樣品，發(fā)現(xiàn)3個地區(qū)的嗜冷菌優(yōu)勢菌群存在相同的菌屬，如假單胞菌屬和乳桿菌屬，但菌群結(jié)構(gòu)有著明顯的差異，不同地區(qū)樣品中假單胞菌相對豐度最低為20.39%，而最高可達(dá)到41.83%；乳桿菌相對豐度最低為21.50%，最高則有41.55%，但作者并未進(jìn)行溯源分析。Siv等[16]研究了挪威兩個不同地區(qū)原料乳中微生物菌群，結(jié)果在檢測出的15個豐度最高的菌屬中，有7個菌屬豐度在兩個地區(qū)間存在顯著差異，尤其是芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬，B地區(qū)75%樣品中檢測出了芽孢桿菌屬細(xì)菌，而A地區(qū)所有樣品都檢出了，類芽孢桿菌屬檢出率在A和B地區(qū)樣品檢出率分別為32%和68%。

1.3 季節(jié)因素

不同的季節(jié)會影響原料乳中嗜冷菌的數(shù)量，其數(shù)值介于1×102~1×107CFU/mL之間浮動[17]。研究發(fā)現(xiàn)韓國京畿省的原料乳樣品在冬季的嗜冷菌數(shù)量高于其他季節(jié)，達(dá)到了3×104CFU/mL，與其他季節(jié)存在著顯著差異[18]。Kable等[19]利用高通量測序研究了美國加利福尼亞圣華金谷春夏秋3個季節(jié)的899輛油罐車中的原料乳菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)樣品中菌群多樣性存在季節(jié)性的差異，春季原料乳樣品中微生物多樣性最為豐富，其中放線菌綱豐度最高，但在這些菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜的原料乳中仍然存在核心菌群，包含了以鏈球菌屬、葡萄球菌屬以及未鑒定的梭菌屬為主的29個OUTs。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，中國上海地區(qū)6月原料乳中微生物菌群多樣性最為豐富，12月則相對較低，總體上存在優(yōu)勢菌群群體，門水平以厚壁菌門、變形菌門和放線菌門為主，且呈動態(tài)平衡關(guān)系；屬水平以假單胞菌屬、不動桿菌屬和乳球菌屬為主。研究表明不同季節(jié)的溫度和濕度決定了原料乳中微生物菌群的多樣性，低溫季節(jié)時(shí)相對豐度最高的是放線菌門，高溫季節(jié)則是以厚壁菌門為主。Yang等[21]研究表明，中國黑龍江省的原料乳中嗜冷菌數(shù)量在夏季顯著高于冬季，嗜冷菌數(shù)量隨季節(jié)變化而波動，其數(shù)量介于2.80 log CFU/mL到5.58 log CFU/mL之間，夏季原料乳中優(yōu)勢菌群主要是腸球菌屬、腸桿菌屬和紫色桿菌屬，占比分別為15.6%、13.7%和9.1%，冬季原料乳中優(yōu)勢菌群以短波單胞菌屬、不動桿菌屬以及鞘氨醇單胞菌屬為主，分別占14.6%、13.2%和13.2%，結(jié)果表明嗜冷菌的濃度和菌群結(jié)構(gòu)隨季節(jié)變化顯著。

總而言之，原料乳中微生物的多樣性在一定程度上受到季節(jié)的影響。掌握原料乳中不同季節(jié)的菌群結(jié)構(gòu)以及其中主要危害菌，能夠?yàn)槟虡I(yè)和相關(guān)部門制定相應(yīng)措施提供一定的參考價(jià)值。

2 原料乳中嗜冷菌可能的來源

原料乳中嗜冷菌污染來源途徑很多，因?yàn)槭壤渚谧匀唤缰蟹植紭O廣，同時(shí)還存在很多人為因素。擠奶設(shè)備未及時(shí)清理、擠奶工人不良習(xí)慣、奶牛身體不健康以及牧場的不規(guī)范管理等都會成為原料乳受到嗜冷菌污染的因素之一。

Conor等[22]研究表明，奶牛的放牧方式（即室內(nèi)放牧或室外放牧）不同會造成原料乳中微生物菌群多樣性的不同，同時(shí)發(fā)現(xiàn)原料乳微生物菌群與乳頭拭子樣品和糞便樣品之間有著明顯的相似性。通過溯源分析發(fā)現(xiàn)，奶牛乳頭表面為最主要污染源，其次是糞便。Ana等[23]分析巴西伯南布哥州質(zhì)量較差的原料乳，發(fā)現(xiàn)原料乳中嗜溫需氧菌、嗜冷菌、凝固酶陽性葡萄球菌和大腸桿菌的數(shù)量分別達(dá)到了8.3×106、2.6×107、1.3×104CFU/mL和3.7×103CFU/mL，在原料乳散裝罐中這些細(xì)菌的數(shù)量同樣如此，甚至更高。作者經(jīng)過溯源分析發(fā)現(xiàn)，罐的殘留水、罐底部、散裝罐內(nèi)、奶牛乳頭、擠奶工具、桶和擠奶工的手都是污染源，但主要污染的原因還是擠奶過程中的不當(dāng)操作或者不良習(xí)慣。Magnusson等[24]通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA對原料乳中蠟狀芽孢桿菌芽孢溯源分析，在擠奶設(shè)備沖洗水中檢測到了每升322個孢子數(shù)，牛圈墊料中檢測到了高達(dá)每克8.7×103個孢子數(shù)量，且墊料孢子數(shù)量與原料乳中孢子數(shù)量成正相關(guān)，表明牛圈所使用的料墊是主要的污染源。

3 原料乳中嗜冷菌多樣性分析方法

3.1 傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)方法主要是依靠培養(yǎng)基的培養(yǎng)、分離、純化、鑒定，主要是根據(jù)菌體的形態(tài)特征、革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)等對嗜冷菌進(jìn)行鑒定[25]。在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)出現(xiàn)之前，這是對微生物分析的唯一方法。參照國標(biāo)SN/T 2552.4-2010[26]和NY/T 1331-2007[27]，對于原料乳中嗜冷菌的計(jì)數(shù)方法可分為2種，一種為6.5℃條件下培養(yǎng)10 d后計(jì)數(shù)，另一種為21℃條件下培養(yǎng)25 h后計(jì)數(shù)。但這兩種方法培養(yǎng)后的計(jì)數(shù)結(jié)果有顯著差異并且沒有相關(guān)性，所以21℃增菌培養(yǎng)的方法并不能替代標(biāo)準(zhǔn)的6.5℃培養(yǎng)方法[28]。這在一定程度上延長了實(shí)驗(yàn)周期。

傳統(tǒng)方法一直沿用至今，盡管可以達(dá)到菌群多樣性分析的目的，但單純基于此方法分析所得到的結(jié)果并不全面。目前能夠在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物只有不到1%，絕大部分細(xì)菌處于一種“存活而不可培養(yǎng)”狀態(tài)[29]。傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒎蛛x菌株鑒定到種，但因嗜冷菌包含多種不同的細(xì)菌，這便暴露了這種方法的短板：工作量巨大并且費(fèi)時(shí)；得到的結(jié)果不夠全面，無法對原料乳中嗜冷菌菌群進(jìn)行全面的分析。

3.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法

因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法存在缺陷以及科技的不斷發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法應(yīng)運(yùn)而生。目前在原料乳嗜冷菌菌群分析方面使用較為普遍的高通量測序、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA和PCR-DGGE技術(shù)。

3.2.1 高通量測序

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing,HTS）又被稱為“下一代”測序技術(shù)（”Next-generation”sequenccing technology，NGS）。以美國羅氏公司所研發(fā)的454測序儀、美英合作研發(fā)的Illumina測序儀以及美國ABI公司研發(fā)的SOLiD測序儀作為代表，這些測序儀都是采用循環(huán)芯片測序法（Cyclic-array sequencing）。此方法的原理簡單來說就是將所需測序的DNA樣品填滿在特制的芯片上，不斷地進(jìn)行PCR反應(yīng)和熒光序列讀取。實(shí)驗(yàn)步驟主要分為樣品分析、文庫構(gòu)建、測序反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析[30]。

2020年，Russo等人[31]通過高通量測序技術(shù)分析了在4℃保存3天后的驢原料乳中微生物菌群，最終將49624個測序樣品分為387個OTUs，分析發(fā)現(xiàn)主要菌群大部分屬于假單胞菌屬，占比高達(dá)93%，并在樣品中發(fā)現(xiàn)了兩類對原料乳安全性有中等影響的危害菌。雖然危險(xiǎn)系數(shù)不高，但是考慮到主要消費(fèi)群體為嬰兒、老人以及免疫力低下人群，相關(guān)部門以及生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)引起重視。雷鳴等[32]通過16SrRNA高通量測序分別分析在4、10、15℃儲藏一定時(shí)間后原料乳中嗜冷菌和細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)4℃條件下儲藏一天后原料乳中嗜冷菌數(shù)占比高達(dá)總菌數(shù)的90%，其中黃桿菌屬的相對豐度最高，為47.66%，假單胞菌屬以39.54%的占比緊隨其后；而在10℃和15℃下分別儲藏72 h和24 h后，細(xì)菌總數(shù)超過了國標(biāo)規(guī)定數(shù)量。盡管國標(biāo)沒有對原料乳中嗜冷菌數(shù)量進(jìn)行明確規(guī)定，但一部分嗜冷菌能夠產(chǎn)耐高溫蛋白酶和耐高溫脂肪酶，這將導(dǎo)致原料乳的品質(zhì)受到影響，使得乳制品貨架期縮短[33]。這表明嗜冷菌在原料乳儲藏運(yùn)輸過程中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制溫度，盡可能快的對原料乳進(jìn)行加工處理，縮短存放時(shí)間。

高通量測序有著如下優(yōu)點(diǎn)：在不需要培養(yǎng)的情況下，直接對樣品進(jìn)行測序分析，可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物都能夠被檢測分析，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，高通量測序操作簡單、節(jié)省時(shí)間、大大減少了實(shí)驗(yàn)的工作量的同時(shí)，更加提高了所獲取數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過測序分析基本可以涵蓋樣品中所有微生物菌群；成本相對較低；測序量大、速度快，能夠同時(shí)對幾十萬乃至更多序列進(jìn)行測序分析，然而高通量測序只能得到樣品中微生物的相對豐度，難以區(qū)分物種OTU。

3.2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)是一種基于PCR建立的技術(shù)，于1990年由Williams等人提出[34]。此技術(shù)通過設(shè)計(jì)隨機(jī)的引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后PCR產(chǎn)物經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳處理，以EB染色后檢測分析研究樣品DNA的多樣性。

Martins等[35]使用RAPD技術(shù)研究了從冷藏生乳中分離出的70株嗜冷菌的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的多態(tài)性片段較多，隨后作者通過Jaccrad系數(shù)計(jì)算遺傳距離，其結(jié)果從11.76%到100%不等，這表明分離株之間存在巨大的遺傳變性。此方法不僅可以用來研究菌群的遺傳多樣性，還可以對污染物進(jìn)行溯源。Eneroth等人[36]通過RAPD技術(shù)在瑞士或挪威的3個牧場中尋找污染源，最終從生奶、巴氏殺菌奶、空氣、水源和包裝罐中檢測到了與污染樣品中革蘭氏陰性嗜冷菌一致的RAPD類型，大部分污染菌歸類于假單胞菌屬。

RAPD技術(shù)在各個領(lǐng)域也已經(jīng)被廣泛運(yùn)用，主要因?yàn)橛兄韵逻@些優(yōu)點(diǎn)：僅需加單個引物，擴(kuò)增時(shí)無特異性；有較高的檢出率；無需專門設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；所需樣品DNA樣品極少；技術(shù)簡單、省時(shí)省力。然而這種技術(shù)也存在一定的缺陷：重復(fù)性和可靠性都不夠高，因?yàn)槿菀资艿椒磻?yīng)條件的影響，如Mg2+離子的濃度、聚合酶的來源等；電泳過程中存在共遷移的問題，導(dǎo)致不能區(qū)分出長度相同而堿基序列不同的片段。

3.2.3 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）是近些年在微生物菌群分析方面較為熱門的一種技術(shù)。此技術(shù)是通過在聚丙烯酰胺凝膠電泳中加入梯度變性劑，根據(jù)不同的DNA片段因其堿基含量不同而造成的雙鏈結(jié)合力不同，不同的DNA片段在變性劑中出現(xiàn)不同的部分解鏈，隨后這些片段因?yàn)檫w移率的改變而被區(qū)分開來，被區(qū)分開的條帶便可通過回收測序和DGGE圖譜計(jì)算得出微生物菌群多樣性。此技術(shù)主要操作流程如下：總DNA提??；16S rDNA或功能基因片段的PCR擴(kuò)增；DGGE電泳；切膠回收后測序；微生物多樣性分析等。

Eric等[37]通過PCR-DGGE技術(shù)檢測了分別CO2、熱殺菌、微過濾處理后和不處理的原料乳在冷藏過程中微生物的多樣性變化，研究發(fā)現(xiàn)原料乳中主要菌群為鏈球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬和氣球菌屬，在原料乳冷藏7天后，假單胞菌屬是CO2處理和未處理原料乳中的主要菌群，而在熱處理和微過濾原料乳中的主要菌群為葡萄球菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬。這說明不同的處理方式能夠在一定程度上影響原料乳中微生物菌群結(jié)構(gòu)，但作者并沒有對菌群的數(shù)量做進(jìn)一步的分析。2013年，唐玲等[38]用PCR-DGGE技術(shù)分析原料乳中主要的污染菌群，檢測出了以豬鏈球菌、馬腸鏈球菌和乳酸鏈球菌為主的12種菌群。除了菌群分析，此技術(shù)同樣可以進(jìn)行污染溯源分析。周國君等[39]通過PCR-DGGE技術(shù)對巴氏滅菌乳中腐敗菌進(jìn)行溯源，發(fā)現(xiàn)原料乳容易在擠乳、包裝環(huán)節(jié)發(fā)生污染。

PCR-DGGE技術(shù)因其高效性和可靠性等而被廣泛運(yùn)用于食品行業(yè)微生物菌群分析和污染溯源，同時(shí)這種方法不依賴于培養(yǎng)，能夠較為全面的反應(yīng)樣品中的微生物菌群結(jié)構(gòu)。但此技術(shù)對樣品處理方式、DNA純度和反應(yīng)條件等要求非常高，同時(shí)電泳過程中存在共遷移問題，且無法檢測出菌體濃度過低的菌群[40]。

4 結(jié)果與展望

如果能夠?qū)⒏鞯貐^(qū)嗜冷菌菌群研究透徹并分析出主要危害菌群，將對奶廠控制污染源以及相關(guān)部門實(shí)施相應(yīng)檢測控制措施提供很大的幫助。隨著HACCP體系的建立和推行，牧場的管理體系也不斷完善，但是如何在“農(nóng)場到餐桌”的過程中落實(shí)到每一個點(diǎn)以及規(guī)范奶農(nóng)的操作仍然有待解決。

如今，通過不依賴培養(yǎng)的方式對菌群進(jìn)行多樣性分析越來越被學(xué)術(shù)界所認(rèn)可，這也使得現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用得到了快速的發(fā)展。但對于原料乳中嗜冷菌的菌群多樣性分析，將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合或許是目前更為合理的方案，對原料乳中大部分嗜冷菌快速檢測和有效的控制仍然是乳制品行業(yè)的一大挑戰(zhàn)。但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展和對嗜冷菌研究的不斷深入，原料乳中嗜冷菌的檢測和控制一定能得到解決。