基質(zhì)固相分散-HILIC-MS/MS法測(cè)定乳制品中5種氨基糖苷類抗生素殘留

王一冉

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210）

0 引 言

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)是一類廣譜抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)上包含兩個(gè)以上氨基糖并由配苷鍵與中心的己糖或戊糖相連[1-2]，是畜牧養(yǎng)殖中的常用藥物[3-4]。由于AGs會(huì)對(duì)人體有損傷，乳制品為國(guó)民日常消費(fèi)品，加強(qiáng)了AGs在動(dòng)物源性食品中殘留的監(jiān)控也十分必要。

大多數(shù)AGs化合物化學(xué)性質(zhì)為弱堿性[5-7]，在加之樣品基質(zhì)為高蛋白和高脂肪含量的乳制品，一般前處理方式下化合物的回收率不理想[8-10]。一般采用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)樣品前處理有嚴(yán)苛要求，同時(shí)測(cè)定時(shí)流動(dòng)相中要加入離子對(duì)試劑，這也會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物回收率較低的問(wèn)題[11-13]。親水交互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一種介于正相色譜與反相色譜之間的一種技術(shù)[14-16]，用于分離強(qiáng)極性的化合物，易與質(zhì)譜聯(lián)用，可解決多種AGs的分離問(wèn)題。同時(shí)前處理采用基質(zhì)固相分散(Matrix solid phase dispersion，MSPD)技術(shù)可有效分離提取復(fù)雜基質(zhì)中強(qiáng)極性的AGs組分，提高了方法的實(shí)用性[17-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1200-API 4000高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,ABSciex公司；Obelisc R色譜柱（2.1mm×100mm，5μm），飛諾美公司；ZIC-HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），沃特世公司；BEH-HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，3μm），島津有限公司。

大觀霉素（99.0%）、鏈霉素（98.0%）、雙氫鏈霉素（99.0%）、阿米卡星（98.0%）、卡那霉星（97.5%），標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；樣品來(lái)源隨機(jī)購(gòu)買于超市的乳制品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取0.5 g樣品，加入二氧化硅和EDTA二鈉鹽填料混勻填入到SPE小柱中?？刂?.0 mL/min速度淋洗小柱后，用2 mL 0.1%甲酸溶液洗脫后收集洗脫液，并定容至2.0 mL，過(guò)0.22μm濾膜后分析。

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

用于親水交互作用色譜的固定相為極性，易吸附樣品溶液中的極性分子，從而促進(jìn)目標(biāo)物從流動(dòng)相中分配至固定相表面上的極性液層。參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-18]，本試驗(yàn)考察烷基三甲銨乙酯的HILIC色譜柱(ZIC-HILIC)、結(jié)合離子交換作用的HILIC色譜柱(Obelisc R)和鍵合相為硅膠的HILIC色譜柱(BEH-HILIC)3種色譜柱，并對(duì)流動(dòng)相溶液進(jìn)行了比較分析。

1.2.3 MSPD條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)針對(duì)洗脫液分別考察了水、0.1%甲酸以及乙腈等溶液[19-20]，以樣品的加標(biāo)回收率考察提取效果。

1.2.4 儀器條件

色譜條件：Obelisc R柱(2.1 mm×100 mm,5μm)；進(jìn)樣量：3μL；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min。洗脫程序見表1，其中流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：選用ESI+電離模式，離子源電壓為4 200 V，離子源溫度為380℃，掃描模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，其他質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 5種AGs質(zhì)譜檢測(cè)的參數(shù)

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，在上述設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、穩(wěn)定性與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較ZIC-HILIC柱、Obelisc R柱以及BEH-HILIC柱發(fā)現(xiàn)，ZIC-HILIC柱和ObliscR柱對(duì)5種AGS組分的分離效果較好，其中ZIC-HILIC柱在流動(dòng)相為乙腈：150 mmol/L乙酸銨-1.0%甲酸(20∶40∶40v/v/v)，條件下5種目標(biāo)物的響應(yīng)值最高；使用Obelisc R柱時(shí)，采用0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫的模式下，也可以實(shí)現(xiàn)氨基糖苷類藥物的分離。

在上述兩種色譜柱優(yōu)化的條件下，分別比較兩種色譜柱的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)MRM圖，如圖1所示。從圖1可以看出，鏈霉素和雙氫鏈霉素在色譜圖上均不能很好的分離，但可以通過(guò)質(zhì)譜分析中不同離子對(duì)進(jìn)行區(qū)分，其中使用Obelisc R柱分析時(shí)各組分的靈敏度優(yōu)于ZIC柱。

圖1 5種AGs在兩種色譜柱中的MRM圖

2.2 基質(zhì)固相分散條件優(yōu)化

結(jié)果如圖2所示，洗脫液為甲酸溶液時(shí)，5種AGs組分回收率最高，其次為水，效果最差的為乙腈，主要是由于5種化合物組分為堿性物質(zhì)，洗脫液為酸性時(shí)目標(biāo)組分容易被洗脫。甲酸溶液作為洗脫液時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)化最佳濃度，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，當(dāng)甲酸溶液濃度選擇0.1%時(shí)，各個(gè)組分的AGs回收率均較好（回收率達(dá)到77.2%～93.6%），進(jìn)一步增加甲酸溶液濃度，5種AGs回收率反而會(huì)下降。

圖2 3種洗脫液對(duì)回收率的影響

圖3 洗脫液濃度對(duì)回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

乳制品樣品中的干擾基質(zhì)較多，如磷脂、蛋白質(zhì)、脂肪等，為了減少此類物質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器產(chǎn)生基質(zhì)干擾，本試驗(yàn)前處理采用乙腈、乙腈-甲酸混合溶液淋洗掉樣品中的干擾物，并優(yōu)化淋洗液中甲酸溶液的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依次以2 mL乙腈、2 mL乙腈-1.0%甲酸（95∶5，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（90∶10，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（85∶15，v/v）的步驟來(lái)淋洗效果最佳，淋洗好后以2 mL0.1%甲酸溶液洗脫得到洗脫液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

如表3所示，5種AGs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9991～0.9999之間，方法的檢出限為2.5～25μg/kg，定量限為8.0～80μg/kg。

表3 5種AGs的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.4.2 穩(wěn)定性與重復(fù)性

在最優(yōu)條件下，對(duì)雙氫鏈霉素和卡那霉素30 ng/mL，大觀霉素60 ng/mL，鏈霉素和阿米卡星300 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HILIC分析，每天測(cè)定3次，連續(xù)一周。結(jié)果表明，5種化合物組分的測(cè)得結(jié)果日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%~3.6%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%~8.7%，說(shuō)明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。

2.4.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別添加2倍定限量、5倍定限量和10倍定限量低、中、高的3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（大觀霉素加標(biāo)量32、80、160μg/kg；鏈霉素和阿米卡星加標(biāo)量160、400、800 μg/kg、雙氫鏈霉素和卡那霉素濃度加標(biāo)量16、40、80μg/kg），測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)加收率。結(jié)果如表4所示，5種化合物組分的AGs平均加標(biāo)回收率范圍在80.5%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.4%～7.1%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

將本方法應(yīng)用于從超市中隨機(jī)抽取的5種品牌共40份乳制品樣品，檢測(cè)5種AGs目標(biāo)組分。。結(jié)果顯示5種AGs殘留含量均低于50μg/kg，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量要求。

3 結(jié) 論

本文建立的基質(zhì)固相分散-親水交互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳制品中5種AGs殘留的分析方法，在對(duì)色譜的條件、基質(zhì)固相分散條件、基質(zhì)效應(yīng)等因素進(jìn)行優(yōu)化后，5種AGs能在2~2 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，5種組分的檢出限范圍為2.5～25μg/kg，定量限范圍為8.0～80μg/kg，加標(biāo)回收率在80.5%～94.3%。所建立的方法有效解決了檢測(cè)氨基糖苷類抗生素時(shí)反相色譜柱上保留性能不佳、回收率低的分析難點(diǎn)，可為乳制品中5種AGs殘留的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。