自動QuEChERS前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS測定生牛乳中112種農(nóng)藥殘留

王帥，趙海濤，閆艷華，劉會會，王雅靜，張亮，王磊

(1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心，河北唐山063000；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北唐山063000）

0 引 言

隨著全球范圍內(nèi)乳及乳制品的需求量增大，世界各國對生牛乳中農(nóng)藥殘留檢測越來越重視[1-4]。生牛乳中的農(nóng)藥殘留主要來源喂食奶牛的飼料，其所含農(nóng)藥種類范圍較廣，殘留量相對較高，但現(xiàn)有的方法難以同時分析生牛乳基質(zhì)中不同類型的農(nóng)藥殘留[5-10]。

目前，按照GB/T 5009.162—2008《動物性食品中有機氯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯農(nóng)藥多組分殘留量的測定》的規(guī)定對生牛乳進行檢測[11]。通過實踐發(fā)現(xiàn)，國標方法操作繁瑣、有機試劑耗費量凈化不充分，導(dǎo)致檢測結(jié)果的不確定性增加。田宏哲等[12]采用乙腈、Oasis HLB提取凈化后，利用HPLC-MS/MS測定牛奶中6種氨基甲酸脂類農(nóng)藥；陳美瑜等[13]利用GC-MS/MS結(jié)合基質(zhì)固相分散前處理對牛奶中32種農(nóng)藥進行檢測；劉毅等[14]建立了牛奶中20種有機氯農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS檢測方法；可以看出，國內(nèi)的研究主要還停留在對單一類農(nóng)藥的檢測[15-16]。因此，建立一種凈化效果好、準確度高，可滿足同時測定生牛乳中多類農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，具有重要意義。

本研究采用自動QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立生牛乳中112種農(nóng)藥殘留的高通量檢測方法，涉及農(nóng)藥種類全，涵蓋了殺蟲劑類、殺菌劑類、除草劑類等農(nóng)藥。前處理方法有效的減少試劑用量，解放勞動力，縮短前處理時間，可滿足國內(nèi)外對生牛乳中農(nóng)藥殘留的測定需求。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LCMS-8040液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI），日本島津公司；SiO-6512全自動前處理設(shè)備，本立科技公司；SZ 13022-NY0.2μm有機濾膜，天津市領(lǐng)航實驗設(shè)備股份有限公司；T-200電子天平，常熟雙杰儀器制造廠。

1.1.2 試劑與材料

標準品氧樂果、二甲戊靈、氟蟲腈等112種均購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；提取劑內(nèi)含5.5 g無水硫酸鎂、1.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉及1 g檸檬酸鈉，凈化劑內(nèi)含4 mm氧化鋯珠5粒、100 mgN-丙基乙二胺（PSA）、600 mg無水硫酸鎂及100 mgC18，氧化鋯珠（R 104）和雙層提取凈化管（V50），均購于本立科技公司；乙腈為色譜純；0.05%甲酸溶液；5 mmol/L甲酸銨溶液；實驗用水為蒸餾水（屈臣氏）；生牛乳樣品，購買于唐山市市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準儲備溶液的配制

混合標準儲備溶液：分別吸取濃度為1 000μg/m L的單個農(nóng)藥標準物質(zhì)100μL，用乙腈定容至10 mL，得到濃度為10μg/mL的混合標準溶液，于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 基質(zhì)混合標準工作液的配制

農(nóng)藥基質(zhì)混合標準工作液：取樣品空白溶液分別配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基質(zhì)混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 精密度測定方法

取空白生牛乳樣品，添加農(nóng)藥混合標準溶液，添加濃度0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個濃度做3個平行，根據(jù)精密度公式可計算樣品精密度。

式中：RSD為相對標準偏差；s為標準偏差；x為算數(shù)平均值；xi為樣品測定值；n為樣品重復(fù)測定次數(shù)。

1.2.4 回收率測定方法

式中：C0為回收濃度；C1為樣品添加濃度。

1.2.5 樣品前處理

稱取5.0 g生牛乳樣品于離心管外管中，加入混合標準溶液（外標法），靜置30 min，加入10 mL乙腈及10 mL水，加入萃取鹽包（內(nèi)含5.5 g無水硫酸鎂，1.5 g氯化鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，1.0 g檸檬酸鈉）及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含4 mm氧化鋯珠5粒，100 mg PSA，600 mg無水硫酸鎂，100 mg C18）后放入自動QuEChERS前處理儀器中開始處理，經(jīng)25 min交替震蕩離心后，從內(nèi)管中取凈化液過0.22μm的有機微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS測定。同時取空白生牛乳樣品，按照上述前處理操作制備樣品空白提取液，用于配制基質(zhì)混合標準工作溶液。

1.2.6 加標回收試驗

在空白樣品中添加混合標準儲備液，添加濃度為0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個添加水平重復(fù)6次。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Phenomenex H 18（50 mm×3.00 mm，2.60μm）；柱溫：40℃；流速：0.40 mL/min；進樣量：2μL；流動相：A相5 mmol/L甲酸銨+0.05%甲酸水溶液、B相純甲醇；洗脫程序：0.5～5.0 min，10%B；5.0～8.0 min，95%B；8.0～10 min，10%B。

電噴霧離子源（ESI）；霧化氣流量3.00 L/min；干燥氣流量15.00 L/min；DL管溫度為250℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

根據(jù)國內(nèi)外乳及乳制品主要農(nóng)藥殘留的種類，本研究一共對115種農(nóng)藥進行了選擇。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)水胺硫磷、殺螟硫磷、異菌脲未出現(xiàn)響應(yīng)；根據(jù)本試驗所確定的分析條件，將質(zhì)量濃度均為0.4μg/mL的112種混合標準溶液進樣，以保留時間定性，HPLC-M S/MS總離子流圖見圖1。由圖1可以看出，112種化合物能在10.0 min內(nèi)峰型尖銳，對稱性好，出峰附近都沒干擾峰，是理想的色譜檢測條件。

圖1 112種農(nóng)藥總離子流圖

2.2 線性關(guān)系、回收率和精密度

通過回收率、線性、精密度對自動QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS方法進行驗證。利用生牛乳空白基質(zhì)配制濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基質(zhì)混合標準工作液；取空白生牛乳樣品，添加農(nóng)藥混合標準溶液，添加水平為0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個濃度重復(fù)6次。根據(jù)樣品回收率計算公式，進而得出平均回收率和相對標準偏差。本研究以待測農(nóng)藥回收率在70%~120%、相對標準偏差小于15%時的最小添加濃度為定量限。112種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)，回收率及精密度結(jié)果見表1。

表1 112種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率及精密度

由上述結(jié)果可以看出，幾乎所有待測農(nóng)藥在生牛乳中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9990~0.9999范圍內(nèi)，得到的回收率均在80.24%~117.67%之間，RSD值為0.27%~14.92%，在對生牛乳112種農(nóng)藥檢測結(jié)果中，農(nóng)藥的定量限為0.01mg/kg，符合痕量分析的要求。進一步表明自動QuEChERS方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對生牛乳中農(nóng)藥殘留檢測具有可行性和通用性。

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.3 實際樣品測定

本方法具有快速、簡便、可操作強、準確度高的優(yōu)點，可應(yīng)用于生牛乳中不同種類農(nóng)藥同時檢測的需求。2020年內(nèi)從市場采集生牛乳樣品260份，采用自動QuEChERS方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行了分析檢測，其中均未有農(nóng)藥檢出，同時取空白樣品進行添加回收實驗，RSD值均＜15%，回收率均在70%~120%之間。結(jié)果表明，本方法能夠滿足大規(guī)模生牛乳中農(nóng)藥的篩查和定量分析。

3 結(jié) 論

本研究建立了自動QuEChERS結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定生牛乳中112種農(nóng)藥殘留的方法。農(nóng)藥標準溶液在0.005~0.2μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)（r）在0.9973~0.9999范圍內(nèi)；在0.02、0.12、0.2 mg/kg的添加濃度下的回收率為80.24%~117.67%，相對標準偏差（RSD=6）為0.27%~14.92%，方法定量限為0.01 mg/kg。該方法保證了定性及定量結(jié)果的準確性，為生牛乳中農(nóng)藥檢測提供了技術(shù)支撐。方法經(jīng)多次驗證，精密度、準確度高，線性關(guān)系好，能夠滿足國家對生牛乳中的農(nóng)藥進行大規(guī)模的篩查和定量分析。