輪狀病毒感染對(duì)宿主天然免疫影響的研究進(jìn)展

王晶瑩，王春鳳，葉麗萍，楊桂連，曹 欣

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬呼腸孤病毒科，有A至H共8種，其中感染A種的最多，病毒顆粒無囊膜，由包裹著11個(gè)基因組雙鏈RNA片段的3層蛋白組成。感染RV可立即激活宿主天然免疫，主要表現(xiàn)為干擾素(interferon,IFN)的分泌，包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型IFN。IFN的分泌導(dǎo)致感染和未感染細(xì)胞中數(shù)百種具有抗病毒活性的干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene,ISG)的表達(dá)。此過程需要模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)的識(shí)別，為引起不同類型IFN和ISG的分泌，機(jī)體通過不同類型的PRRs來識(shí)別RNA病毒，主要有Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)、視黃醇誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)樣受體(NOD-like receptors，NLR)。這些PRRs識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，細(xì)胞分泌的IFN和其受體結(jié)合，通過自分泌和旁分泌，激活JAK-STAT通路，誘導(dǎo)大量ISGs的表達(dá)，ISGs可限制病毒生命周期的各個(gè)階段(進(jìn)入、脫殼、轉(zhuǎn)錄、翻譯、組裝和釋放),從而建立抗病毒狀態(tài)。

雖然在病毒基因組合成過程中通常會(huì)激活I(lǐng)FN通路，但RV采取多種措施保護(hù)其感染期間不受天然免疫攻擊。病毒在與宿主長(zhǎng)期的斗爭(zhēng)中，必須要通過各種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，比如抑制IFN產(chǎn)生、破壞IFN的信號(hào)傳導(dǎo)、逃避宿主的識(shí)別、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬等。RV也可通過多種途徑來逃避天然免疫，其非結(jié)構(gòu)蛋白2(non-structural protein 2，NSP2)可介導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factors,IRF)、RIG-Ⅰ、β轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(β-transducin repeat-containing protein,β-TrCP)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription,STATs)等宿主免疫應(yīng)答通路中重要分子的降解；VP3可介導(dǎo)線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)降解、阻止2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(OAS) / RNase L通路的激活以及作為蓋帽酶保護(hù)病毒轉(zhuǎn)錄過程中免受宿主識(shí)別；RV為了避免在復(fù)制過程中基因組被細(xì)胞識(shí)別，編碼了一些蛋白與RNA結(jié)合，如非結(jié)構(gòu)蛋白2(non-structural protein 2，NSP2)和結(jié)構(gòu)蛋白2(viral protein 2，VP2)。在體外，RV通過內(nèi)體-溶酶體途徑降解來消耗多種類型的干擾素受體(interferon receptor,IFNR)，可抑制IFN介導(dǎo)的STAT1活化和轉(zhuǎn)錄[1]。

1 NSP1拮抗天然免疫

NSP1蛋白由RV的第5段基因編碼，對(duì)于病毒復(fù)制不是必須的，NSP1基因被截短的毒株與野生型相比，在細(xì)胞中的復(fù)制滴度相似，但噬菌斑較小，表明NSP1對(duì)于RV在細(xì)胞間的傳播至關(guān)重要。NSP1是RV蛋白質(zhì)組中保守程度最低的成員，不同來源毒株的NSP1差異較大。NSP1蛋白的C末端序列可變性最高，它通過C末端與不同宿主蛋白相互作用，以蛋白酶體依賴的方式誘導(dǎo)IRF3降解；N端有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，使NSP1發(fā)揮E3泛素連接酶功能，降解IRFs和β-TrCP蛋白，阻斷IFN信號(hào)通路和NF-κB通路。

1.1 NSP1多種途徑拮抗干擾素應(yīng)答

干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族以其在干擾素誘導(dǎo)中的作用而得名，廣泛影響細(xì)胞免疫反應(yīng)。IRFs(IRF1-IRF9)N端含有保守的DBD結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別IFN基因啟動(dòng)子區(qū)域和ISGs中的干擾素刺激反應(yīng)元件(IFN-stimulated response elements,ISREs)；IRF3-IRF9中C端IRF結(jié)合結(jié)構(gòu)域IAD1和IRF1/IRF2中的IAD2介導(dǎo)IRF的同源和異源二聚化以及與其他轉(zhuǎn)錄因子(包括STAT家族成員)的結(jié)合，來自PRRs的刺激信號(hào)誘導(dǎo)IAD磷酸化或二聚化，導(dǎo)致IRF核轉(zhuǎn)位和DBD與ISREs結(jié)合，上調(diào)ISGs的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。

研究顯示，野生型NSP1通過蛋白酶體途徑可使IRF3快速降解——IRF3二聚化和核轉(zhuǎn)位嚴(yán)重降低，缺乏IFN啟動(dòng)子活性，而C端截短的NSP1不能誘導(dǎo)IRF3蛋白的降解，盡管N端RING結(jié)構(gòu)域?qū)SP1蛋白與IRF3的結(jié)合也是必須的[2]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，破壞NSP1的RING結(jié)構(gòu)域后，NSP1不能與IRF3相互作用使其降解，證明NSP1可能作為E3泛素連接酶發(fā)揮功能。IRF3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的被NSP1降解的宿主蛋白，IRF5、IRF7和IRF9也是NSP1介導(dǎo)降解的靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮Y(jié)構(gòu)域上與IRF3相似[3]。通過將IRF3截短，證明IAD為SA11-4F NSP1降解所需的最小結(jié)構(gòu)域，且NSP1只識(shí)別含有IAD1的IRF[3]。IRF4、IRF6和IRF8也具有C末端IAD1結(jié)構(gòu)域，NSP1是否能介導(dǎo)它們的降解還需進(jìn)一步研究。

1.2 NSP1拮抗核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路

與IRFs一樣，在天然免疫反應(yīng)中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)家族的轉(zhuǎn)錄因子p50、p52、p65、RelB和c-Rel發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。IκB是NF-κB的抑制體，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，與NF-κB形成無活性的復(fù)合物。來自PRRs和其他分子的信號(hào)激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物，IκB激酶復(fù)合物將IκB磷酸化，該磷酸二聚體被β-TrCP識(shí)別，為E3泛素連接酶的SCF家族提供靶向性，SCFβ-TrCP誘導(dǎo)磷酸化的IκB翻轉(zhuǎn)，釋放NF-κB移位到細(xì)胞核，并在IFN和ISG啟動(dòng)子區(qū)域與κB基因結(jié)合。

與大多數(shù)RVA毒株的NSP1蛋白不同，OSU NSP1誘導(dǎo)β-TrCP 的蛋白酶體依賴性降解[5]。β-TrCP是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信號(hào)通路的中心靶標(biāo)。因此，p65不會(huì)移位到細(xì)胞核，p50也不會(huì)與DNA結(jié)合，達(dá)到抑制NF-κB通路的作用。據(jù)報(bào)道，RV NSP1需要宿主Cullin-E3連接酶復(fù)合物來降解β-TrCP。對(duì)HT-29細(xì)胞宿主基因表達(dá)的微陣列分析表明，感染SA11-4F、Wa或牛A5-13 RVA上調(diào)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha-inducible protein 3,TNFAIP3)基因的轉(zhuǎn)錄[6]。TNFAIP3(或A20)是一種鋅指蛋白，可在包括PRRs在內(nèi)的眾多刺激下抑制NF-κB的激活[7]。NSP1殘基101和C末端之間的NSP1區(qū)域(不包括N端RING域)介導(dǎo)與TRAF2的相互作用介導(dǎo)蛋白酶體依賴的TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)的降解，抑制NF-κB非經(jīng)典途徑的活化[8]。其他一些毒株的NSP1也可介導(dǎo)TRAF2的降解，如SA11和OSU毒株。

1.3 NSP1介導(dǎo)視黃醇誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體及其接頭蛋白的降解

RIG-Ⅰ、黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation associated gene-5,MDA5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology2,LGP2)通過DExD/H-box解旋酶和C末端結(jié)構(gòu)域識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中dsRNA。當(dāng)與dsRNA結(jié)合時(shí)，RIG-Ⅰ和MDA5中的N末端caspase招募結(jié)構(gòu)域(CARD)介導(dǎo)與MAVS的結(jié)合和寡聚化，最終導(dǎo)致IRF和NF-κB的激活。與大多數(shù)RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)與RIG-Ⅰ或MDA5相互作用不同，輪狀病毒可被RIG-Ⅰ和MDA5單獨(dú)或聯(lián)合識(shí)別，沉默RIG-Ⅰ或MDA5或它們的共同接頭蛋白MAVS可顯著降低感染的腸上皮細(xì)胞中IFN-β的產(chǎn)生，增加輪狀病毒滴度。SA11 NSP1通過其C末端與MAVS的CARD和TM結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，與全長(zhǎng)的NSP1相比，A5-16 NSP1 不能阻斷MAVS聚集體的形成和IFN-β的誘導(dǎo)，從而證實(shí)了NSP1 C末端在拮抗MAVS中的作用。

1.4 NSP1與細(xì)胞凋亡：NSP1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)通路的激活和p53的降解

細(xì)胞被病毒感染后，細(xì)胞啟動(dòng)早期凋亡機(jī)制將病毒限制在少數(shù)細(xì)胞內(nèi)，抑制病毒大量復(fù)制并感染其他細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多病毒通過P13K/Akt通路來防止細(xì)胞過早凋亡。RVA A5-13可誘導(dǎo)蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及其底物之一糖原合酶激酶3β(GSK3β)快速而持久的磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的延遲[9]。但RVA A5-16在感染細(xì)胞中沒有此作用，A5-13 NSP1與PI3K的P85亞基相互作用，表明NSP1的C-末端區(qū)域可能是這種聯(lián)系所必需的。P13K由2個(gè)亞基組成，即p110和p85，其中2個(gè)異構(gòu)體(p85α和p85β)通常與病毒蛋白相互作用[7,10]。NSP1的N端和C端片段均可與P85α相互作用，但P85β優(yōu)先與全長(zhǎng)NSP1結(jié)合。由于PI3K/Akt通路也可激活I(lǐng)SGs的轉(zhuǎn)錄，NSP1可能有助于中和這一反應(yīng)，發(fā)揮拮抗天然免疫的效應(yīng)[10]。PI3K/Akt活性的靶標(biāo)之一是p53，它是一種應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和其他過程中發(fā)揮重要作用。Bhowmick R等[11]研究表明，SA11-4F的NSP1介導(dǎo)了p53的轉(zhuǎn)錄后耗盡，且全長(zhǎng)的NSP1誘導(dǎo)蛋白酶體途徑的p53降解，而C末端截短的NSP1沒有這種作用。NSP1通過C末端與p53的DBD結(jié)構(gòu)域相互作用。

1.5 NSP1與STAT家族

大多數(shù)ISG的表達(dá)依賴于STAT1，STAT1招募干擾素受體，隨后JAK磷酸化絡(luò)氨酸殘基(Y701)，STAT1的磷酸化導(dǎo)致STAT1、STAT2和IRF9的復(fù)合物在Y701位點(diǎn)上形成，被稱為干擾素刺激因子3(interferon-stimulated factor 3，ISGF3)，誘導(dǎo)包括ISRE和IFN-γ激活位點(diǎn)(GAS)的抗病毒ISGs的轉(zhuǎn)錄。Ⅲ型干擾素通過pY701-STAT1/ISGF3發(fā)揮作用。因此IFN下游的抗病毒反應(yīng)依賴于STAT-Y701的磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，RV不僅可以抑制感染細(xì)胞中STAT-Y701的磷酸化，還可介導(dǎo)未感染細(xì)胞中的這種抑制作用。進(jìn)一步研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1可抑制STAT-Y701的磷酸化，且不是通過RING結(jié)構(gòu)域[12]。另外有研究認(rèn)為，NSP1的第47位氨基酸后的殘基可能對(duì)STAT有抑制作用。

2 除NSP1外其他蛋白拮抗天然免疫的機(jī)制

2.1 VP3拮抗天然免疫

完整的MAVS信號(hào)在誘導(dǎo)IFN對(duì)PAMPs的應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，并對(duì)后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答也至關(guān)重要[13]。研究表明，VP3 通過N端結(jié)構(gòu)域可與MAVS直接作用，導(dǎo)致MAVS的降解，這種影響通過一種新的磷酸化基序SPLTSS完成，且似乎受宿主范圍限制[14]。C端的PDE結(jié)構(gòu)域可阻止RNaseL的激活[15]?？偟膩碚f，VP3是兩種蛋白的綜合體，當(dāng)病毒轉(zhuǎn)錄本從RV DLPs中出現(xiàn)時(shí)，VP3會(huì)對(duì)其進(jìn)行封蓋，增加其轉(zhuǎn)譯活性，也可阻止宿主RNA傳感器的激活，它通過裂解信號(hào)分子2-5A直接拮抗dsRNA應(yīng)答的OAS/RNase L通路[16]。在感染期間，VP3也可能在細(xì)胞的兩個(gè)不同區(qū)域發(fā)揮作用，在病毒顆粒內(nèi)作為蓋帽酶，也可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)作為直接的天然免疫拮抗劑。

2.2 NSP2、VP2、NSP3幫助病毒RNA逃避天然免疫

NSP2是一種非特異性的ssRNA結(jié)合蛋白。VP2有較強(qiáng)的RNA結(jié)合活性[17]，可能因?yàn)镹SP2和VP3與RNA相互作用形成復(fù)合物，避免了PRRs對(duì)RNA的識(shí)別。再加上VP3對(duì)RNA的封蓋作用，雖然可能并不完全，但一定程度上發(fā)揮了逃避天然免疫的作用。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3蛋白C末端取代多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(poly(A)-binding protein,PABP)與真核細(xì)胞翻譯啟始因子elF4G相互作用，抑制細(xì)胞mRNA的翻譯，NSP3也可與病毒轉(zhuǎn)錄本3′端UGACC序列結(jié)合，刺激病毒mRNA翻譯[18]。

3 輪狀病毒激活天然免疫機(jī)制

3.1 NSP4激活天然免疫

NSP4是一種跨膜糖蛋白，參與病毒的復(fù)制，在體內(nèi)與一系列細(xì)胞相互作用，啟動(dòng)一系列信號(hào)通路，并有助于輪狀病毒感染[19]。輪狀病毒新合成的雙層病毒粒子DLPs通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽獲得最外層的VP4和VP7，最后通過裂解或胞吐的方式將子代病毒粒子排出細(xì)胞[20]，此過程需要NSP4蛋白參與[21]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，從輪狀病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取的NSP4蛋白可與不同細(xì)胞結(jié)合，包括免疫細(xì)胞。Kavanagh O V等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NSP4在小鼠體內(nèi)與模型抗原共同免疫時(shí)具有佐劑樣效應(yīng)，進(jìn)一步說明NSP4可能在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面發(fā)揮作用。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，NSP4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，刺激炎性因子的產(chǎn)生，此過程是通過TLR2受體以及MyD88接頭蛋白介導(dǎo)的，NSP4誘導(dǎo)IKKα和IKKβ亞單位，p38和JNK磷酸化，從而引起NF-κB通路的激活[23]。

3.2 其他病毒結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物對(duì)天然免疫的激活

輪狀病毒入侵后激活細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)通常涉及的兩種PRRs為RIG-Ⅰ和MDA5，然后觸發(fā)MAVS的激活。激活這些受體的可能是RV的5′磷酸基團(tuán)，不完全的甲基化5′Cap結(jié)構(gòu)和局部的dsRNA[24]。除了RIG-Ⅰ和MDA5外，RV還可激活LGP2(RLR家族的第3個(gè)成員)以及dsRNA依賴的蛋白激酶PKR，導(dǎo)致細(xì)胞分泌IFN[24]。

NOD樣受體(NOD-like receptors,NLR)蛋白炎癥體亞家族是NLRs家族成員中最豐富也是最復(fù)雜的亞家族，被激活后與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬氨酸蛋白酶-1(cysteiny laspartate-specific protease-1,caspase-1)形成炎癥小體復(fù)合物，并介導(dǎo)促炎因子分泌和細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白Gasdermin-D(GSDMD)誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[25]。此過程不僅有助于宿主防御細(xì)菌及其他微生物感染，還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。研究發(fā)現(xiàn)，Nlrp9b在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)RV短dsRNA延伸時(shí)，被RNA解旋酶Dhx9識(shí)別，與Nlrp9b形成復(fù)合物而激活Nlrp9b，限制RV的復(fù)制[26]。

4 結(jié)語

輪狀病毒必須克服宿主的抗病毒反應(yīng)才能成功復(fù)制，在復(fù)制的所有階段都與宿主相互作用，隨著宿主進(jìn)化出防御病原體的機(jī)制，病毒反過來又進(jìn)化出逃避宿主免疫反應(yīng)的策略。NSP1在拮抗先天免疫中扮演著重要作用，從逃避宿主PRRs的識(shí)別，到從各個(gè)方面抑制INF通路和NF-κB通路發(fā)揮抗病毒作用，還可抑制細(xì)胞過早凋亡，有助于輪狀病毒的復(fù)制和感染。關(guān)于NSP1還有許多問題，NSP1具有如此多的功能，但多種不同的宿主蛋白是如何結(jié)合到NSP1 C端同一位點(diǎn)的？仍有待深入探究。其次，VP3在逃避天然免疫的識(shí)別中也有著突出貢獻(xiàn)，N端和C端分別發(fā)揮作用，一方面防止病毒RNA被宿主識(shí)別，另一方面抑制IFN通路的激活。另外，還有其他蛋白在病毒復(fù)制中扮演著不同的角色。了解輪狀病毒與宿主先天免疫的相互作用，才能更好地對(duì)抗它們，研制新型抗病毒藥物，減少輪狀病毒給人類帶來的危害。