豬輪狀病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

楊志剛，湯德元，張 森，韓超逸，晏仁潭

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是導(dǎo)致哺乳仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一。英國(guó)于1974年首次報(bào)道了該病，隨后在北美洲、南美洲、非洲和澳大利亞都有報(bào)道該病。我國(guó)于1981年首次分離到該病毒，目前PoRV在東北、華北、華南、西北等地都有報(bào)道[1-3]。該病毒通過(guò)糞-口途徑傳播，感染腸道腸上皮細(xì)胞，臨床癥狀為腹瀉、嘔吐、厭食、脫水。豬輪狀病毒是呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，是一種雙鏈RNA病毒，基因組包含11段雙鏈RNA，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)病毒蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5/6)。輪狀病毒基于其VP6蛋白抗原性不同分為10個(gè)基因群(A-J)，其中RVA、RVB和RVC與仔豬腹瀉有關(guān)，幾十年前就發(fā)現(xiàn)豬的RVE，但不常見(jiàn)，近年來(lái)在日本、巴西和美國(guó)發(fā)現(xiàn)了豬的RVH[4]。尚無(wú)針對(duì)該病毒的有效治療藥物，雖然開(kāi)發(fā)出了相應(yīng)的疫苗，但由于PoRV區(qū)域流行不同和遺傳多樣性，導(dǎo)致該病毒不能完全被控制。輪狀病毒基因群、基因型多樣及該病毒與豬其他引起腸道癥狀病毒發(fā)病癥狀相似，在臨床上難以辨別，故對(duì)本病即時(shí)準(zhǔn)確診斷方法的建立就顯得尤為重要。本文總結(jié)了PoRV的檢測(cè)技術(shù)，旨在為PoRV的現(xiàn)場(chǎng)診斷和預(yù)防該病提供技術(shù)支持。

1 傳統(tǒng)方法

1.1 病毒的分離培養(yǎng)

PoRV的分離培養(yǎng)可以采用MA104細(xì)胞系、Marc-145細(xì)胞系和Vero細(xì)胞系等。時(shí)洪艷等[5]從內(nèi)蒙古某豬場(chǎng)患病豬腹瀉糞便中分離1株病毒，將該分離株在MA104細(xì)胞上進(jìn)行盲傳，連續(xù)傳至25代，并進(jìn)行3次蝕斑純化，通過(guò)電鏡觀察、PCR鑒定和序列測(cè)定進(jìn)行分析，分離出1株P(guān)oRV。楊文宇等[6]從四川仔豬腹瀉樣品中分離到1株P(guān)oRV，并通過(guò)PCR檢測(cè)、病毒理化試驗(yàn)與微量中和試驗(yàn)證實(shí)，命名為SC-R株，同時(shí)將SC-R株接種Marc-145細(xì)胞，盲傳至第4代出現(xiàn)CPE，第6代出現(xiàn)典型的PoRV病變特征，研究表明胰酶可增加PoRV對(duì)細(xì)胞的感染性，最為適用的胰酶濃度是30 g/L。楊娟等[7]將1份經(jīng)RT-PCR檢測(cè)PoRV陽(yáng)性腹瀉糞樣品經(jīng)胰酶處理后接種Vero細(xì)胞，盲傳至第8代出現(xiàn)了明顯的病變，提取該細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)顯示擴(kuò)增條帶與目的條帶相符，測(cè)序結(jié)果與其他PoRV毒株相近，成功分離出PoRV。然而，不管采用哪種細(xì)胞分離培養(yǎng)該病毒，都有分離周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、基層應(yīng)用少等缺點(diǎn)。

1.2 電鏡觀察診斷法

電鏡觀察診斷技術(shù)包括直接電鏡法和免疫電鏡檢測(cè)法。直接電鏡法是最早用于檢查糞便中RV的方法，該法操作簡(jiǎn)便，觀察到輪狀病毒大小和形狀的病毒即可判定為陽(yáng)性；免疫電鏡法主要利用特異性抗體俘獲病毒，可通過(guò)觀察聚集的病毒抗原復(fù)合物來(lái)判斷結(jié)果，也可以使用多價(jià)抗體，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)其他與腹瀉有關(guān)的病毒的要求。Mebus等于1969年通過(guò)電鏡觀察診斷成功分離出世界上首例牛輪狀病毒。Benfield D A等[8]比較了商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、電鏡觀察(electron microscopy,EM)、熒光抗體(fluorescent antibody,FA)和病毒分離(virus isolation,VI)檢測(cè)牛和豬RV的靈敏度，對(duì)73份牛和116份豬種樣品進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示，對(duì)于牛的樣品，商業(yè)ELISA與EM一樣靈敏且比FA和VI靈敏，對(duì)于豬的樣品，EM比FA、ELISA和VI更為敏感。但由于電鏡法需要更高的設(shè)備和較高的成本投入，它不適合大規(guī)模樣品檢測(cè)及廣泛推廣。

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是根據(jù)抗原與抗體結(jié)合原理來(lái)對(duì)PoRV進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，但每次試驗(yàn)必須有陽(yáng)性對(duì)照。Memon A M等[9]基于RVA VP6定向的兔多克隆抗體，開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)PoRVA抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(AC-ELISA)，對(duì)中國(guó)不同省份收集的295份豬糞便/腹瀉樣品進(jìn)行了評(píng)估，并與常規(guī)RT-PCR和RT-qPCR進(jìn)行了比較，敏感性和特異性分別為91.67%和100%，且不與PEDV、TGEV、PRV和PCV2發(fā)生血清交叉反應(yīng)。

2.2 免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)

免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)是基于免疫標(biāo)記技術(shù)和色譜層析技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種可用于檢測(cè)抗原、抗體或半抗原的檢測(cè)技術(shù)。Kang J H等[10]建立了一種快速簡(jiǎn)便的免疫層析試紙條檢測(cè)方法，用于糞便標(biāo)本中PoRV的特異性檢測(cè)，在小鼠中產(chǎn)生了針對(duì)PoRV OSU株的單克隆抗體，其中，選擇了2個(gè)對(duì)VP6有特異性的單克隆抗體-1和單克隆抗體-2，將單克隆抗體-1用于包被微粒，而將單克隆抗體-2固定在硝酸纖維素膜條上以形成檢測(cè)線，通過(guò)固定抗小鼠IgG抗體，在經(jīng)過(guò)檢測(cè)線的同一膜帶上形成對(duì)質(zhì)控線，該方法能夠在不到5 min檢測(cè)1 000個(gè)PoRV/mL的斑塊形成單位，并且特異性良好，對(duì)14份樣品進(jìn)行檢測(cè)，有9份陽(yáng)性，5份陰性，與RT-PCR結(jié)果一致，該方法快速簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，準(zhǔn)確廉價(jià)。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

3.1 RT-PCR

現(xiàn)已有多種檢測(cè) PoRV的PCR方法報(bào)道。根據(jù)輪狀病毒VP6蛋白特異性抗原決定簇(SGⅠ、SGⅡ、SG(Ⅰ+Ⅱ)和無(wú)SG(Ⅰ+Ⅱ))將輪狀病毒分為至少4個(gè)亞組，然而，針對(duì)人和豬輪狀病毒VP6蛋白表位的單克隆抗體有時(shí)不能識(shí)別SG特異性表位或識(shí)別無(wú)關(guān)的SG表位，因此導(dǎo)致亞組的錯(cuò)誤分配，為區(qū)分這4種亞組，Thongprachum A等[11]基于VP6基因組設(shè)計(jì)了2對(duì)引物開(kāi)發(fā)了一種多重RT-PCR，通過(guò)新的多重RT-PCR方法確定的人和豬輪狀病毒的基因組與通過(guò)單一RT-PCR和VP6序列分析確定的基因組具有100%的一致性，該方法特異性高、靈敏度好、耗時(shí)少，且成功地對(duì)兒童和仔豬急性腹瀉中傳播的輪狀病毒臨床分離株進(jìn)行了基因分組。張雙翔等[12]針對(duì) PoRV VP6和VP7基因設(shè)計(jì)了2對(duì) RT-PCR特異性引物，并分別建立了檢測(cè)PoRV VP6基因和VP7基因的RT-PCR快速方法，使用這2種檢測(cè)方法對(duì)臨床102份樣品進(jìn)行檢測(cè)，二者陽(yáng)性檢出率無(wú)差異性(P>0.05)。

在實(shí)際應(yīng)用中，很多疫病都能導(dǎo)致豬的腹瀉，因此能夠快速地區(qū)分臨床癥狀及病理變化相似的病例的多重PCR方法得到了快速的發(fā)展。Zhao J等[13]建立了一種能同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、PoRVA和PCV2的多重RT-PCR檢測(cè)方法，該4種病毒的敏感性分別為2.17×103、2.1×103、1.74×104、26×104copies/μL。Liu G等[14]建立了同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、RVA、RVC和PCV2的多重PCR，該試驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)分該5種病毒，而不會(huì)與豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬細(xì)小病毒1型(PPV1)、CSFV、豬博卡病毒(PBoV)和豬星狀病毒(PAstV)發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法每次反應(yīng)每種病毒最低限度為50 copies/μL。蒲翠敏等[15]建立了建立一種同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV和PoRV的三重PCR檢測(cè)方法，該方法能夠擴(kuò)增出PEDV、TGEV和PoRV特異性片段，且不能檢出PCV2、CSFV、PRRSV，對(duì)PEDV、TGEV和PoRV質(zhì)粒模板的最低檢測(cè)量分別為1×102、1×100、1×103copies/μL。苗艷等[16]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、PoRV和豬嵴病毒(PKV)多重RT-PCR檢測(cè)方法，PEDV、TGEV、PoRV和PKV的最低檢出量分別為1.33×104、1.33×103、1.33×104、1.33×105copies/μL。Ding G等[17]建立了能同時(shí)檢測(cè)PKV、TGEV、PEDV、豬δ冠狀病毒(PDCoV)、PoRVA和札幌病毒(PSaV)的多重RT-PCR方法，該方法每次反應(yīng)每種病毒最低限度為100ng～101ng cDNA，并且未與PRRSV、CSFV、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)和口蹄疫病毒O型(FMDV-O)的cDNA和PRV的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。曲雅新等[18]建立一種同時(shí)檢測(cè)PRoV、豬札幌病毒(PoSaV)和豬星狀病毒(PAstV)的三重PCR方法，該方法對(duì)TGEV、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等常見(jiàn)豬病病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,PRoV、PoSaV和PAstV的檢測(cè)限量分別為1.38×102、8.33×102、4.40×103copies/μL。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time RT-PCR，RT-qPCR)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，通過(guò)熒光信號(hào)積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品模板進(jìn)行定量分析的方法，該技術(shù)不僅能定性還能定量。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多用于檢測(cè)PoRV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。高婉俊等[19]建立了檢測(cè)豬RVA的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，建立的方法在1.0×102copies/μL～1.0×109copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，反應(yīng)擴(kuò)增效率大于90，擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)大于0.98，對(duì)CSFV、PRRSV、TGEV和PCV2均檢測(cè)不到熒光信號(hào)，表明該方法特異性強(qiáng)，該方法批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，重復(fù)性好。陳如敬等[20]建立了檢測(cè)PoRV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法最低檢測(cè)量為192 copies/μL，對(duì)豬常見(jiàn)病原(如TGEV、PEDV、CSFV等)檢測(cè)均為陰性，使用該方法和常規(guī)RT-PCR對(duì)79份豬腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，符合率達(dá)100%。

檢測(cè)PoRV的多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法已有多個(gè)報(bào)道。Marthaler D等[21]建立了能同時(shí)檢測(cè)RVA、RVB和RVC的多重RT-qPCR方法，并對(duì)7 508份豬腹瀉樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率分別為62%、33%、53%，該方法能更好地對(duì)豬的RVA、RVB和RVC進(jìn)行監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究，從而最終獲得更好的預(yù)防和控制策略。李軍等[22]建立了同時(shí)檢測(cè)TGEV、PEDV和PoRVA的多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法，該方法能夠特異性檢測(cè)PEDV、TGEV和PRoVA，而與其他病原無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)TGEV、PEDV和PoRVA的最低檢測(cè)量分別為1.12、39、25 copies/μL；組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%；該方法與商品化的試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100 %。Wen D等[23]建立了能同時(shí)檢測(cè)TGEV、RVA、RVC、PEDV和PCV2的多重RT-qPCR方法，該方法對(duì)檢測(cè)和區(qū)分TGEV、RVA、RVC、PEDV和PCV2具有很高的靈敏度，檢測(cè)限為5 copies/μL～50 copies/μL，重現(xiàn)性好，Tm和循環(huán)閾值的變異系數(shù)分別小于0.32%和2.86%，通過(guò)單次和多次RT-qPCR對(duì)90個(gè)現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行測(cè)試，符合率為91.1%，該EvaGreen RT-qPCR方法快速、靈敏、低成本。施開(kāi)創(chuàng)等[24]建立了同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法特異性較強(qiáng)，對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限分別為2.06×102、2.06×102、2.06×101、2.06×103copies/μL，具有較高敏感性，組內(nèi)與組間變異系數(shù)均小于1.1%，具有良好的重復(fù)性。Jia S等[25]基于DPO引物建立了能同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV多重實(shí)時(shí)SYBR Green RT-PCR檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)的引物相比，DPO引物允許更寬的退火溫度范圍(40℃～65℃)，對(duì)PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的檢出限分別為8.63×102、1.92×102、1.74×102、1.76×102copies/μL。許夢(mèng)怡等[26]建立了同時(shí)檢測(cè)TGEV、PEDV、PoRV的三重?zé)晒舛縋CR方法，該方法對(duì)TGEV、PEDV、PoRV的檢測(cè)靈敏度分別為2.49、4.36、4.96 copies/μL。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便。Hu X等[27]建立了可以用于檢測(cè)PoRV的RT-LAMP測(cè)定方法，依據(jù)GenBank上登錄的PoRV VP7基因保守序列設(shè)計(jì)了6條特異性引物，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，該方法靈敏度達(dá)到了102copies/μL，只有PoRV獲得特異性擴(kuò)增條帶，與其他TGEV、PEDV、CSFV等無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，發(fā)生反應(yīng)后用肉眼檢查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)白色沉淀，加入SYBR Green Ⅰ發(fā)生顏色變化可判定結(jié)果，該方法可以快速、特異、靈敏的檢測(cè)PoRV。

3.4 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)(ISH)是一種用于檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片內(nèi)特定核酸序列的方法。與PCR相似，ISH基于DNA和RNA序列，但具有識(shí)別組織學(xué)病變內(nèi)核酸的能力。傳統(tǒng)的ISH技術(shù)具有良好的特異性，但由于短核苷酸序列的標(biāo)記效率較低，因此敏感性有限。Resende P等[28]建立了一種基于RNA的原位雜交顯色技術(shù)，以檢測(cè)RVA、RVB、RVC，該方法與其他病毒不存在交叉反應(yīng)，探針具有良好的特異性，但靈敏度不高，最多只能檢103copies/mL RV RNA。

3.5 納米孔測(cè)序技術(shù)

納米孔測(cè)序儀由牛津納米孔技術(shù)公司于2014年發(fā)布，該設(shè)備簡(jiǎn)單便攜，可通過(guò)一臺(tái)筆記本電腦在現(xiàn)場(chǎng)完成目標(biāo)檢測(cè)，它有低成本、單分子測(cè)序、測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)控和超長(zhǎng)讀長(zhǎng)等特點(diǎn)[29]。Theuns T等[30]首次應(yīng)用納米孔測(cè)序作為豬病毒性腸炎的診斷工具，研究了納米孔測(cè)序用于病毒檢測(cè)的能力，首先，將細(xì)胞培養(yǎng)的豬流行性腹瀉病毒和RVA混合，并在MinION上測(cè)序，測(cè)序開(kāi)始后7 s已檢測(cè)到讀數(shù)，3 h后測(cè)序深度較高(19.2 X～103.5 X)，接下來(lái)，分析了1周齡仔豬的腹瀉糞便，幾乎所有讀物(99%)都屬于噬菌體，這可能重塑了仔豬的微生物組，更重要的是一種豬嵴病毒被發(fā)現(xiàn)。通過(guò)納米孔測(cè)序樣品中所有病毒和其他病原體可以在一次讀數(shù)中給出，而無(wú)需進(jìn)行其他診斷測(cè)定。目前，定價(jià)可能是妨礙獸醫(yī)學(xué)樣品高通量分析的一個(gè)方面，但是隨著技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)將在不久的將來(lái)在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，檢測(cè)技術(shù)均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)：①病毒的分離培養(yǎng)具有分離周期長(zhǎng)、花費(fèi)高、基層應(yīng)用少等不足，但可以分離出病毒，從而進(jìn)行進(jìn)一步研究；②電鏡觀察診斷法需要較高的設(shè)備和專業(yè)人員投入，不適合大規(guī)模樣品檢測(cè)以及廣泛的進(jìn)行推廣；③免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性并且檢測(cè)成本較高，其中免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)雖然靈敏度有待提高，但快速簡(jiǎn)單、易于實(shí)施和準(zhǔn)確廉價(jià)，適合基層應(yīng)用；④分子生物學(xué)技術(shù)缺點(diǎn)是費(fèi)用高，但具有較高的靈敏度和特異性，且可以區(qū)分其不同基因型。因此，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇不同的檢測(cè)方法。

很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)于PoRV的檢測(cè)技術(shù)做了很多探索，開(kāi)發(fā)了一些在PoRV鑒定方面有很好應(yīng)用前景的方法，但還是存在使用限制、檢測(cè)成本和檢測(cè)結(jié)果的靈敏度等問(wèn)題。目前，我國(guó)PoRV流行率不斷增加，遺傳多樣性越來(lái)越高，且我國(guó)有關(guān)PoRV流行病學(xué)方面的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少，因此，PoRV的檢測(cè)方法應(yīng)該進(jìn)行不斷更新，以期對(duì)PoRV進(jìn)行更精確的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和防控。