基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究8 w中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠肝臟蛋白質(zhì)組的影響

蘇醒 蘇巍

(1淮安信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部，江蘇 濰安 223003；2上海交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

衰老機(jī)體內(nèi)環(huán)境生物學(xué)特性改變，引起結(jié)構(gòu)變化和功能失調(diào)及相關(guān)疾病的發(fā)生〔1〕。肝臟是體內(nèi)最大實(shí)質(zhì)器官，約占人體總重量的2%，具有儲(chǔ)存、分泌、解毒等代謝功能。肝臟是個(gè)體衰老過(guò)程中最易受累的器官之一。研究表明相對(duì)于年輕個(gè)體，老年個(gè)體更容易罹患肝臟疾病，如肝炎、非酒精性脂肪肝、肝臟纖維化等〔1，2〕。系列文獻(xiàn)報(bào)道，增齡性大鼠的肝臟組織伴有過(guò)度的氧化應(yīng)激〔3〕、纖維化〔4〕、炎癥反應(yīng)〔5〕、肝細(xì)胞再生能力下降〔6〕、糖脂代謝失調(diào)〔7〕、肝細(xì)胞線粒體生物更新和自噬能力下降〔7〕、肝細(xì)胞凋亡〔8〕等過(guò)程，這些增齡性功能改變將顯著增加肝臟的胰島素抵抗、脂肪肝病變、肝纖維化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，探究肝臟的抗衰老機(jī)制對(duì)于揭示預(yù)防衰老相關(guān)的肝臟病變的藥物靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)有效的干預(yù)手段具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

體育運(yùn)動(dòng)對(duì)包括肝臟在內(nèi)的多種組織具有系統(tǒng)性的抗衰老效應(yīng)〔9〕。研究表明，中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)能提高增齡大鼠肝臟的抗氧化酶活性〔10，11〕，提高老齡大鼠肝臟線粒體氧化磷酸化〔12〕和能量代謝水平〔13〕及胰島素的敏感性〔14〕，抑制炎癥因子表達(dá)和纖維化程度〔15〕。研究發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)能經(jīng)G蛋白調(diào)控增齡大鼠肝細(xì)胞胰高血糖素(glucagon)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB介導(dǎo)的氧化還原信號(hào)和胰島素受體底物(IRS)-1介導(dǎo)的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP)-1B胰島素敏感性信號(hào)通路〔14〕。有研究認(rèn)為運(yùn)用“組學(xué)(-omics)”研究技術(shù)將是未來(lái)揭示體育運(yùn)動(dòng)延緩衰老分子機(jī)制的重要途徑〔16〕。包括蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)在內(nèi)的組學(xué)技術(shù)均以其高分辨率、高流通量等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于對(duì)疾病機(jī)制研究〔17，18〕。尤其近年來(lái)在肝臟生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較為普遍〔19〕，然而，在運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域鮮有研究。因此，本研究通過(guò)雙向凝膠電泳(2-DE)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)，研究8 w中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)對(duì)18月齡増齡大鼠肝臟組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜的影響，揭示長(zhǎng)期訓(xùn)練延緩肝臟衰老的整體機(jī)制，為體育運(yùn)動(dòng)延緩衰老的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 IPGphor等電聚焦電泳系統(tǒng)(Amershan Pharmacia公司)、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳槽(購(gòu)自bio-rad公司)、MDLDI-TOF MS質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics公司)、GDS 8000pc凝膠成像分析系統(tǒng)(中晶科技)；固相pH梯度等電聚焦千膠條(Immobilise dry strip pH3～10、長(zhǎng)度18 cm，Amersham公司)、載體兩性電解質(zhì)pH3～10和pH5～8(Amersha公司); V5111胰蛋白酶(Trypsin，Promega公司)；基質(zhì)-氰-4-羥肉桂酸(美國(guó)ICN生物醫(yī)學(xué)公司)；碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺和三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為化學(xué)分析純(上海生物工程技術(shù)有限公司)；線粒體丙二醛(MDA)、錳離子超氧化物歧化酶(MnSOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2樣品制備

1.2.1分組與實(shí)驗(yàn)方案 12只18月齡清潔級(jí)雌性SD大鼠購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，體重(378±11)g，清潔級(jí)。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，室溫20～24℃、光照7∶00～19∶00。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組。負(fù)荷強(qiáng)度參照李方暉等〔18〕。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8 w中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)(速度15 m/min，60%～70% max)跑臺(tái)坡度5°，每組15 min，5 d/w。

1.2.2肝臟組織的蛋白提取 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后24 h，運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組同時(shí)麻醉，測(cè)量體重和肝臟稱重。對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組大鼠肝臟組織40 mg，置于2 ml離心管中，剪成小塊；然后加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)后超聲，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，重復(fù)該步驟兩次。常溫干燥5 min后，30℃恒溫水浴溶于裂解液中，體積比1∶8加入裂解液{7 mol/L尿素；4% 3-〔3-(膽酰胺丙基)二甲氨基〕丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)；2 mol/L硫脲；60 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)；10 mmol/L 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)；1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；1 mmol/L PMSF；0.5 %兩性電解質(zhì)(CA)}，室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清，并再次離心取上清。收集樣品置于-80℃冰箱內(nèi)。

1.32-DE分離、染色和圖像分析 雙向電泳分離參照Amersham Biosciences公司，具體實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)〔17，18〕。銀染法顯色2-DE重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，GDS 8000pc凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，Image Master 2D 5.0軟件對(duì)圖像蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)背景扣除匹配分析。

1.4基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)蛋白鑒定 酶解選擇重復(fù)性好、無(wú)明顯變形拖尾的蛋白質(zhì)點(diǎn)，然后將肽段提取液干燥后，加入2.5 L的0.5%(V/V)三氟乙酸(TFA)溶液溶解肽段，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)〔17，18〕，以MALDI-TOF質(zhì)譜分析進(jìn)行多肽質(zhì)量指紋圖譜的分析與比較。

1.5MDA、MnSOD、GSH及GSSH測(cè)定 依南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用Image Master 2D Platinum V5.0分析軟件檢驗(yàn)差異蛋白點(diǎn)相對(duì)含量的差別是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠肝臟抗氧化酶的影響 與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組GSH、MnSOD活性、GSH/GSSH比值分別增加了138% (P<0.05)、33% (P<0.05)和306% (P<0.01)；MDA和GSSH分別減少了60% (P<0.05)和71%(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組MDA、GSH、GSSH、MnSOD比較

2.2運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠肝臟組織全蛋白質(zhì)影響 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量位于20～90 kD，對(duì)照組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目約為600個(gè)。運(yùn)動(dòng)組肝臟全蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目分布規(guī)律和分子量大小與對(duì)照組很相似，只存在著少量差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，如圖1標(biāo)識(shí)號(hào)碼為 A1～A19和圖 2標(biāo)識(shí)號(hào)碼為 B1～B16共35個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，無(wú)蛋白缺失。其中，與圖2相比，圖1中7個(gè)斑點(diǎn)(A2、A8、A9、A10、A12、A13和A16)上調(diào)超過(guò)2倍；與圖1相比，圖2中的5個(gè)斑點(diǎn)(B2、B5、B6、B8和B10)上調(diào)超過(guò)2倍；其他的23個(gè)差異斑點(diǎn)變化均在1～2倍。

圖1 運(yùn)動(dòng)組肝臟全蛋白2-DE

2.3差異蛋白質(zhì)鑒定 對(duì)圖3所顯示的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行逐一鑒定與分析(PMF和MASCOT網(wǎng)站提供的檢索工具)。檢索基本條件為：PMF圖譜中的肽片段質(zhì)量為600～3 000 Da，最大允許誤差為0.2 Da，離子類型選擇單同位素分子量〔M+H〕+，酶解的漏切位點(diǎn)為1/2個(gè)。對(duì)12個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其檢索與比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。蛋白質(zhì)斑點(diǎn)均獲得有意義檢索結(jié)果，得分均>50分，具有一定的可信度。

圖2 對(duì)照組肝臟全蛋白2-DE

A.：對(duì)照組；B：8 w運(yùn)動(dòng)組圖3 大鼠肝臟表達(dá)的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)局部放大圖(×10)

表2 運(yùn)動(dòng)后增齡大鼠肝臟表達(dá)的差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

續(xù)表2 運(yùn)動(dòng)后增齡大鼠肝臟表達(dá)的差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

3 討 論

3.1運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠肝臟氧化-抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 除了作為體內(nèi)最大實(shí)質(zhì)消化器官，肝臟還兼具儲(chǔ)存、分泌、解毒等代謝功能。如肝臟在增齡過(guò)程會(huì)因抗氧化酶活性下降導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。Momchilova等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，增齡大鼠肝臟MnSOD、GSH活性顯著降低，而活性氧和表征脂質(zhì)過(guò)氧化的MDA顯著增加。蔣春筍等〔11〕研究表明，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)降低線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換開(kāi)放的敏感性來(lái)抑制衰老組織線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生，進(jìn)而減輕線粒體的氧化損傷。研究證實(shí)，抗氧化物白藜蘆醇也能通過(guò)調(diào)節(jié)GSH、MnSOD活性來(lái)保護(hù)增齡大鼠肝臟組織的氧化應(yīng)激損傷〔20〕。總之，中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)可通過(guò)MnSOD、GSH活性來(lái)抑制增齡大鼠肝細(xì)胞線粒體活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而維持肝細(xì)胞的氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)。

3.2運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟蛋白質(zhì)圖譜的影響 本文參見(jiàn)萬(wàn)莉莉等〔17〕選用的丙酮/三氯乙酸(TCA)沉淀法提取大鼠肝臟全蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，全蛋白質(zhì)經(jīng)2-DE分離后，選用丙酮/TCA沉淀法制備的大鼠肝臟全蛋白質(zhì)斑點(diǎn)均有較高的分辨率，分布趨勢(shì)較為均勻，蛋白分離較好，重復(fù)性較好。其中，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，pH3.0～10.0范圍的載體兩性電解質(zhì)是最佳等電點(diǎn)分離區(qū)域，可有效分離全蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

本研究中對(duì)照組圖譜與Hu等〔21〕文獻(xiàn)中報(bào)道的大鼠肝臟組織的全蛋白圖譜一致，但不同于大鼠的骨骼肌〔18〕、腦組織〔22〕和心肌組織〔23〕等全蛋白質(zhì)分布特點(diǎn)。本研究結(jié)果推測(cè)，差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與運(yùn)動(dòng)提高肝臟抗氧化活性、延緩肝臟組織衰老的應(yīng)激適應(yīng)性蛋白質(zhì)有關(guān)。

3.3運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠肝臟蛋白質(zhì)圖譜差異蛋白分析 表2中的 12個(gè)差異蛋白質(zhì)分別可分為5個(gè)功能類別：(1)脂肪酸合成及其炎癥反應(yīng)；(2)糖代謝；(3)抗氧化、解毒；(4)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)；(5)應(yīng)激反應(yīng)蛋白。

3.3.1脂代謝相關(guān)蛋白 脂肪酸合成酶(FAS)(A2)和11-羥化類固醇脫氫酶(11β-HSD1)(A10)主要存在于肝臟、脂肪等組織中，分別作為合成脂肪酸和催化無(wú)活性的可的松為氫化可的松關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝和炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用。劉云〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，11β-HSD1刺激3T3-Ll細(xì)胞的分化過(guò)程中與FAS的上調(diào)有關(guān)。快速老化小鼠(SAMP8)和增齡大鼠(22月齡)實(shí)驗(yàn)表明，增齡會(huì)誘導(dǎo)肝臟組織脂質(zhì)代謝傾向于脂肪過(guò)度合成〔25〕，導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和衰老的加劇，F(xiàn)AS〔26〕和11β-HSD1〔27〕扮演重要角色。與自然衰老大鼠模型相似，非酒精性脂肪肝大鼠模型進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟FAS〔28〕、11β-HSD1〔29〕表達(dá)顯著減少，從而有利于降低體內(nèi)脂肪堆積和炎癥反應(yīng)。

3.3.2糖代謝相關(guān)蛋白 α-烯醇化酶(α-enolase)(A9)和葡萄糖磷酸變位酶(PGM)(B5)分別是糖酵解和糖原合成及分解的關(guān)鍵酶，二者與機(jī)體糖代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。然而，肝細(xì)胞病變過(guò)程中，肝臟組織α-enolase分泌增加導(dǎo)致誘導(dǎo)肝臟纖維化和肝細(xì)胞損傷〔30〕；PGM表達(dá)水平減少導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體能量代謝水平及ATP合成降低，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡〔31〕。Lushchak等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加肝細(xì)胞PGM蛋白表達(dá)，進(jìn)而維持肝臟組織的能量平衡。

3.3.3抗氧化、脫毒性和凋亡相關(guān)蛋白 乙基丙二酸腦病變相關(guān)蛋白(ETHE1)(A13)基因編碼硫加氧酶(SDO)，在肝臟中高度表達(dá)，參與將線粒體中硫化氫(H2S)催化為無(wú)毒的硫酸鹽〔33〕。ETHE1蛋白表達(dá)與機(jī)體的最大吸氧量呈正相關(guān)〔34〕，ETHE1蛋白表達(dá)下調(diào)易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)硫代謝途徑失調(diào)，引發(fā)線粒體功能失調(diào)〔33〕。此外，ETHE1也能通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；?HDAC)1活性抑制p53誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡〔35〕。作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞角蛋白的重要組成之一，角蛋白8(K8)被認(rèn)為是肝組織損傷和肝細(xì)胞凋亡的標(biāo)示物〔36〕，對(duì)維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整具有重要的生理作用〔37〕，同時(shí)參與調(diào)控肝細(xì)胞線粒體的能量代謝和氧化應(yīng)激過(guò)程〔38〕。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)催化底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，后者是主要體內(nèi)的甲基供體及GSH的前體物質(zhì)。肝臟組織SAMs失活導(dǎo)致的甲硫氨酸代謝途徑失調(diào)引起肝細(xì)胞FAS表達(dá)增加和脂肪酸過(guò)度堆積，同時(shí)肝臟炎癥因子過(guò)度表達(dá)，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡發(fā)生〔39〕。核基質(zhì)結(jié)合因子(SAF)B是一種核基質(zhì)結(jié)合因子，定位于核基質(zhì)中，已被證實(shí)在多種細(xì)胞學(xué)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括RNA轉(zhuǎn)錄后加工，細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞衰老和凋亡等。研究表明，SAFB通過(guò)它的N-末端結(jié)合域與p53抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制其下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄〔40〕。

3.3.4蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白 蛋白酶體β亞單位(PSMB)6參與構(gòu)成26 S蛋白酶體蛋白水解的核心區(qū)，26 S是20 S蛋白水解酶家族成員之一。PSMB6對(duì)于維持肝組織功能、肝細(xì)胞活性具有重要作用〔41〕。Hayashi等〔42〕研究發(fā)現(xiàn)，增齡大鼠肝細(xì)胞內(nèi)聚集大量無(wú)法水解的結(jié)構(gòu)異常是蛋白質(zhì)與26 S蛋白酶體含量減少有關(guān)。核糖核酸酶抑制因子(RNH)1是一種多功能的體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)分子，是核糖核酸酶(RNase)的抑制劑，它與RNase緊密結(jié)合，導(dǎo)致核糖核酸酶的活性受到抑制。在衰老過(guò)程中，人體RNH1活力下降，RNase活力上升，RNA降解加快和蛋白合成速度下降，引起組織萎縮、生理功能下降。結(jié)合本研究可推測(cè)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)調(diào)節(jié)26 S蛋白酶體和RNH1來(lái)優(yōu)化肝臟組織的蛋白質(zhì)代謝過(guò)程，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

3.3.5應(yīng)激反應(yīng)蛋白 在炎性應(yīng)激刺激下，肝臟大量合成并分泌相關(guān)的急性期蛋白，如，觸珠蛋白(HPT)、主要急性期蛋白(MAP)1。MAPα-1是一種正相急性期蛋白，又稱T-kininogen 2，具蛋白酶抑制、巰基蛋白酶抑制劑、血管擴(kuò)張的功能，在急性反應(yīng)期對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。HPT主要由肝細(xì)胞分泌，與肥胖相關(guān)的肝臟組織纖維化的和肝臟胰島素信號(hào)激活有關(guān)〔43〕。提示，肝臟組織的分泌行為適應(yīng)性變化也介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)肝臟組織的保護(hù)過(guò)程。然而值得指出的是，作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌組織，衰老大鼠的肝臟組織分泌行為在運(yùn)動(dòng)后的適應(yīng)性變化在肝臟自身及系統(tǒng)性功能維護(hù)過(guò)程中扮演何種角色有待進(jìn)一步研究揭示。

綜上，中等強(qiáng)度低負(fù)荷量訓(xùn)練后增齡大鼠肝臟的蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜發(fā)生顯著性變化；體育運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟的糖脂代謝、蛋白質(zhì)代謝、脫毒性和抗凋亡等過(guò)程來(lái)延緩肝臟組織衰老的作用。