“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對(duì)MID大鼠海馬M受體、CREB含量的影響及其相關(guān)性

羅本華 曾啟峰 吳小玲 李玉秋 王燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

血管性癡呆(VD)是臨床可防治的癡呆類型，也可能是中國(guó)老年期癡呆的首發(fā)原因〔1〕；針灸防治VD是臨床廣泛共識(shí)，具有有效無(wú)毒、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)〔2〕。近年來(lái)，“益氣調(diào)血，扶本培元”藥線灸為防治VD新方法，具備了(生命)三焦氣化與癡呆間的“相關(guān)論”〔3〕、“發(fā)病觀”〔4〕、病機(jī)觀〔5〕及“論治觀”〔6〕等中醫(yī)理論支撐，也取得臨床改善VD學(xué)習(xí)、記憶障礙核心癥狀〔7，8〕的有效性和全面改善多發(fā)梗死性癡呆模型(MID)大鼠的認(rèn)知障礙功能〔9〕的神經(jīng)行為學(xué)等基礎(chǔ)證據(jù)；概括其特點(diǎn)是：恢復(fù)三焦氣化，促使精氣神正常互化，恢復(fù)癡呆腦神功能；疏通三焦通道，暢達(dá)三焦氣機(jī)，三焦上通下達(dá)使內(nèi)生水濕痰毒瘀血排有去路，改善腦神功能的腦微環(huán)境，以利腦神功能顯達(dá)；故該藥線灸法是針對(duì)VD基礎(chǔ)病理和基礎(chǔ)辨病病機(jī)的干預(yù)方法。在前期該藥線灸法改善MID模型大鼠中樞乙酰膽堿(ACh)障礙機(jī)制〔10，11〕的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)初探了該藥線灸對(duì)乙酰膽堿受體(AChR)作用和其胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠70只，體重(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度45%，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，標(biāo)準(zhǔn)粒飼料定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)15 d。

1.1.2試劑及藥物 大鼠毒蕈堿型AChR(M受體)、大鼠毒蕈堿型AChRM1(M1受體)、大鼠毒蕈堿型AChRM2(M2受體)ELISA KiT 96T(武漢基因美生物科技有限公司)；大鼠環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒96T(上海聯(lián)碩生物)；鹽酸多奈哌齊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978，衛(wèi)材藥業(yè)，5 mg/片，配成濃度10%的藥液使用)；水合氯醛AR250G；2號(hào)壯醫(yī)藥線(直徑0.5 mm，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院提供)。

1.1.3主要儀器 單道可調(diào)整支消毒移液器(10、200、1 000 μl)，酶標(biāo)儀(LabsystemsMultiskan)，洗板機(jī)(ThermoLabsystems)，TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，HH.CP-01W隔水式恒溫培養(yǎng)箱，12號(hào)彎錫灌胃針(GWL-12W)，Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，PR0200電動(dòng)玻璃勻漿儀。

1.2MID造模方法

1.2.1動(dòng)物分組 70只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分至預(yù)用栓子造模組60只和正常組10只；經(jīng)Morris水迷宮，栓子造模組篩選出癡呆鼠40只，隨機(jī)分至模型組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組，各組10只。

1.2.2MID大鼠造模方法〔4〕采取同種大鼠股動(dòng)脈血，在無(wú)菌條件下置37℃保溫箱內(nèi)，自然干燥24 h，經(jīng)100目篩子過(guò)篩，制備小于200 μm的備用血凝塊。臨用時(shí)，按每10 mg血栓加0.3 ml生理鹽水制成混懸液。按35 mg/100 g體重，3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。頸正中切開皮膚(約1 cm)，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸外動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈上兩分支，避開兩分支，分別在頸外動(dòng)脈上備2根手術(shù)縫合線，近心端先套一活結(jié)，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。用兒科4號(hào)頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動(dòng)脈至右頸內(nèi)動(dòng)脈起始處，再用1 ml注射器緩慢注入0.3 ml栓子鹽水懸液，60～90 s內(nèi)注盡，使栓子經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈，造成多灶性腦梗死，再結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合皮膚。將慶大霉素滴注切口處防感染。正常組手術(shù)方法與模型鼠制作一樣，但只注射0.3 ml生理鹽水。

1.3模型成功判定標(biāo)準(zhǔn) 栓子造模組于造模后7 d進(jìn)行連續(xù)5 d的Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)訓(xùn)練，1次/d。以正常組第5天的平均逃避潛伏期為參考值，計(jì)算栓子造模組第5天的平均逃避潛伏期與參考值之差值與該鼠平均逃避潛伏期的比值，該值>20%定為癡呆鼠。本課題只用篩選過(guò)的癡呆鼠作為MID模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法與操作參考文獻(xiàn)進(jìn)行〔12〕。

1.4干預(yù)治療

1.4.1藥物治療 藥物組于造模并癡呆篩選后將1 mg/(kg·d)鹽酸多奈哌齊溶于2 ml生理鹽水中灌胃，于每日早晨8∶00灌胃。

1.4.2藥線灸組治療 按“益氣調(diào)血、扶本培源”治則并采用針刺方法的組穴，取中脘、膻中、氣海及血海雙、足三里雙(華興邦動(dòng)物穴位圖譜)。藥線灸操作方法：按《壯醫(yī)藥線灸療法》采用2號(hào)藥線(直徑0.5 mm)，采用輕刺激手法和“先上后下、先軀干再四肢、先陽(yáng)后陰”順序，點(diǎn)灸以上腧穴各1壯。

1.4.3藥線非穴組藥線灸方法 選用雙側(cè)肋下兩個(gè)固定非穴點(diǎn)，針刺雙側(cè)肋下各兩個(gè)固定非穴點(diǎn)〔13〕，約相當(dāng)于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作為對(duì)照刺激點(diǎn)，輕刺激手法藥線灸左3右4壯，或左4右3壯，交替。

1.4.4模型組與正常組治療 兩組均給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。

1.4.5療程 5組均于模型篩選后，采用相應(yīng)方法干預(yù)治療，1次/d，6次/w，治療4 w。

1.5觀察方法

1.5.1海馬組織取材方法 于干預(yù)方案結(jié)束后的次日早晨8∶00，斷頭處死實(shí)驗(yàn)大鼠，開顱迅速取出全腦組織，冰上操作，干凈分離海馬組織，即用冰冷生理鹽水沖洗血液，電子天平稱重后，迅速置于-80℃冰箱凍存，待相關(guān)檢測(cè)。

1.5.2總M受體、M1受體、M2受體與CREB含量測(cè)定 標(biāo)本融化后保持6℃的溫度備用，按0.1 g加0.9 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)比例稀釋，冰上用超聲勻漿器充分勻漿標(biāo)本；3 000 r/min離心5 min；收集上清液，分裝待檢。按照各試劑盒步驟，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測(cè)M1受體、M2受體、總M受體與CREB的樣本含量。各項(xiàng)檢測(cè)均設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔和樣品孔；標(biāo)準(zhǔn)品孔均加50 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；樣品孔先加10 μl待測(cè)樣本，再加40 μl樣本稀釋液；樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔每孔加入10 μl辣根酶標(biāo)記抗體，置于37℃水浴鍋中溫育60 min，反復(fù)洗板5次，吸水紙拍干。各孔均加入底物A、B各50 μl，避光條件下37℃孵育15 min；加入50 μl終止液。用450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計(jì)算各樣品的M1受體、M2受體、總M受體及CREB的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、DunnettT3檢驗(yàn)；以相關(guān)數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析和二元線性回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1藥線灸對(duì)海馬M受體與CREB含量的影響 在M1受體、總M受體及CREB含量上：模型組、藥物組及藥線非穴組均比正常組顯著降低(P<0.01，P<0.05)；模型組與藥線非穴組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥線灸組與藥物組均較二者有顯著性升高(P<0.05)；藥線灸組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而總M受體方面，藥線灸組顯著高于藥物組(P<0.01)。

在M2受體含量上：模型組比藥線非穴組及正常組均顯著性升高(P<0.010)，藥線非穴組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；藥線灸組與藥物組均較模型組顯著性降低(P<0.05,P<0.01)；藥線灸組與正常組、藥線非穴組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而藥物組顯著高于正常組及藥線非穴組(P<0.01)；藥物組與藥線灸組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組海馬總M受體、M1受體、M2受體與CREB含量比較

2.2藥線灸對(duì)大鼠海馬M受體與CREB含量影響的相關(guān)及二元線性回歸分析 正常組、模型組、藥線灸組、藥物組、藥線非穴組M1受體、總M受體與CREB均呈顯著正相關(guān)性(r=0.953、0.943、0.808、0.657、0.865、0.961、0.927、0.813、0.882、0.683，均P<0.05)，M2受體與CREB呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.955、-0.915、-0.911、-0.952、-0.944，均P<0.05)。

3 討 論

學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙是VD的核心癥狀，本實(shí)驗(yàn)采用Kaneko等〔14〕、陳俊拋等〔15〕、劉存志〔16〕的MID大鼠造模及改進(jìn)方法，通過(guò)結(jié)扎頸外動(dòng)脈，經(jīng)頸總動(dòng)脈由頸內(nèi)動(dòng)脈注入血栓造成其支配區(qū)域的缺血缺氧或壞死，造成腦細(xì)胞及神經(jīng)纖維功能的受損，模擬VD的病理。Morii〔17〕證明了MID大鼠模型存在記憶力障礙，并取得MID造模引起相關(guān)的大腦半球區(qū)域損害的病理證據(jù)，提示MID模型的可靠性；彭康等〔18〕進(jìn)一步證明MID模型大鼠腦缺血后膽堿能神經(jīng)元缺失是造成學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因之一；張崇泉等〔19〕認(rèn)為 MID模型非常接近于人類自然栓塞過(guò)程，很好模擬了人類VD的基本病因病理，表現(xiàn)了核心的學(xué)習(xí)記憶障礙癥狀。因此MID模型大鼠是評(píng)價(jià)抗VD治療作用和探討其作用機(jī)制研究，尤其是認(rèn)知損傷最敏感的邊緣系統(tǒng)如海馬膽堿能記憶障礙機(jī)制研究較公認(rèn)的動(dòng)物模型。

哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶活動(dòng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是海馬，而海馬學(xué)習(xí)、記憶功能又依賴M受體的調(diào)節(jié)〔20〕；海馬神經(jīng)元的退變、凋亡會(huì)使M受體相應(yīng)減少，與VD記憶功能障礙相一致，而M受體由多種亞型組成，總M受體反映了多種受體亞型的綜合作用；海馬組織中以M1、M2受體分布最多，通常認(rèn)為M1和M2受體是在海馬水平調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的主要參與者，海馬內(nèi) M1受體興奮、活性增強(qiáng)則引起 ACh 釋放增加，則促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶，而M2受體激動(dòng)活性增強(qiáng)引起 ACh釋放減少，導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能減退；如研究表明腦內(nèi)M受體減少或活性降低及M1受體mRNA表達(dá)的降低可能是VD大鼠認(rèn)知障礙的基礎(chǔ)〔21〕。CREB在哺乳動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶中起著關(guān)鍵作用，調(diào)控著細(xì)胞學(xué)習(xí)記憶功能；研究表明〔22〕血栓性VD模型大鼠海馬CA1區(qū)CREB的表達(dá)下降，而針刺可以增加CREB的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元和改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。因而總M受體及M1、M2受體、CREB都在哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)起關(guān)鍵作用，其指標(biāo)的檢測(cè)能反映VD認(rèn)知功能障礙的相關(guān)狀態(tài)?；谇捌凇耙鏆庹{(diào)血、扶本培元”藥線灸改善中樞ACh代謝障礙的作用機(jī)制〔10〕的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MID模型大鼠存在細(xì)胞膜總M受體、M1，M2受體及胞核CREB損傷降低的基礎(chǔ)；不管生理上還是病理上，總M受體、M1受體與CREB均呈顯著正相關(guān)性，M2受體與CREB呈顯著負(fù)相關(guān)性；說(shuō)明MID模型大鼠存在中樞胞外ACh信息傳遞障礙到胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙等系列發(fā)病機(jī)制，從而導(dǎo)致中樞膽堿能系統(tǒng)損傷突出的認(rèn)知功能障礙；通過(guò)藥線灸法或多奈哌齊藥物治療顯示：(1)均有顯著升高M(jìn)ID模型大鼠海馬內(nèi)M1受體含量，上調(diào)了中樞ACh遞質(zhì)含量，相應(yīng)與細(xì)胞記憶相關(guān)的胞內(nèi)CREB含量顯著上調(diào)；M1受體與胞內(nèi)CREB指標(biāo)間呈正相關(guān)性，反映膽堿能神經(jīng)元組織記憶與細(xì)胞記憶的一致性改變，從而改善VD認(rèn)知功能障礙，而藥線灸治療顯示一定的療效優(yōu)勢(shì)；(2)均有顯著降低MID模型大鼠海馬內(nèi)M2受體含量，上調(diào)了中樞ACh遞質(zhì)含量，相應(yīng)胞內(nèi)CREB含量顯著上調(diào)；M2受體與胞內(nèi)CREB指標(biāo)間呈負(fù)相關(guān)性，反映膽堿能神經(jīng)元組織記憶與細(xì)胞記憶的一致性改變，從而改善VD認(rèn)知功能障礙，而藥線灸治療顯示一定的療效優(yōu)勢(shì)；(3)均有顯著升高M(jìn)ID模型大鼠海馬內(nèi)總M受體含量，總體與中樞ACh遞質(zhì)含量升高一致，相應(yīng)胞內(nèi)CREB含量顯著上調(diào)；且總M受體與胞內(nèi)CREB指標(biāo)間呈正相關(guān)性，反映膽堿能神經(jīng)元組織記憶與細(xì)胞記憶得到一致性調(diào)整，從而改善VD認(rèn)知功能障礙；由于總M受體反映了多種受體亞型的綜合作用，實(shí)驗(yàn)總M受體檢測(cè)結(jié)果水平作用大致反映與M1、M2受體水平的協(xié)同作用，保持與CREB含量的一致性改變，是以藥線灸組協(xié)同改善VD認(rèn)知障礙功能顯示更好療效。綜合結(jié)果顯示“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸法可能經(jīng)調(diào)控M受體及M1，M2受體、CREB信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，起到調(diào)控中樞ACh遞質(zhì)信息傳遞的M受體及其胞內(nèi)CREB細(xì)胞信號(hào)通路，在膽堿神經(jīng)元組織記憶和細(xì)胞記憶等方面改善了VD中樞ACh障礙的發(fā)病機(jī)制，從而改善VD認(rèn)知障礙功能；提示該藥線灸法可能經(jīng)由調(diào)控ACh-M受體-CREB信息信號(hào)通路起到改善VD認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制。