植物三萜類成分生物合成中氧鯊烯環(huán)化酶與細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展

田榮，谷巍，2，韋陳彬，徐飛，邱蓉麗，張阿琴，季媛媛，李桃

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

三萜類成分是以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元組成的具有多種結(jié)構(gòu)的30碳天然產(chǎn)物，在藥物、食品等行業(yè)被廣泛應(yīng)用[1]。三萜類成分具有降糖、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、護(hù)肝、抗病毒等生物活性[2-4]，同時(shí)其在植物體中可以防御病蟲害[5]。由于三萜類成分的結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，在植物中含量較低且常以多種結(jié)構(gòu)相近的成分混合存在，難以通過提取分離或化學(xué)合成方法獲得。合成生物學(xué)的發(fā)展為獲取大量高價(jià)值三萜類成分提供新思路。

三萜類成分在植物體內(nèi)主要以甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑合成，可分為三個(gè)階段：①2,3-氧化鯊烯(2,3-Oxidosqualene)的合成：乙酰輔酶CoA(Acetyl-CoA)在一系列酶催化作用下形成異戊烯焦磷酸酯(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)，IPP與二甲基烯丙基焦磷酸酯(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)在法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS)的作用下縮合生成法呢基焦磷酸酯(Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)，2個(gè)FPP分子在鯊烯合成酶(Squalene synthetase，SS)催化作用下轉(zhuǎn)化為角鯊烯(Squalene)，進(jìn)一步在鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SE)作用下轉(zhuǎn)化為2,3-氧化鯊烯[6-7]。②2,3-氧化鯊烯的環(huán)化：該物質(zhì)是植物甾醇和三萜類成分生物合成的共同前體物質(zhì)，其在氧鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene cyclase，OSC)的作用下合成多種構(gòu)象和結(jié)構(gòu)各不相同的三萜碳骨架[8]，這些骨架是構(gòu)成功能上不同的三萜類成分的基礎(chǔ)(圖1)。③環(huán)上復(fù)雜的官能化修飾：細(xì)胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450)參與催化三萜骨架空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性氧化，形成具有各種功能的官能團(tuán)，如羥基、羰基和羧基等[9]。目前有關(guān)三萜類合成途徑第一階段關(guān)鍵酶的研究比較多，而由于OSC和CYP450的種類非常多，作用機(jī)理也比較復(fù)雜，目前對(duì)這2類酶研究較少。OSC和CYP450與三萜的多樣性密切相關(guān)，因此，OSC和CYP450的克隆和功能研究對(duì)解析三萜類成分的生物合成途徑有著重要作用。

注：AACT.乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(Acetyl-CoA acetyltrans-ferase)；HMGS.羥甲基戊二酰CoA合酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase)；HMGR.羥甲基戊二酰CoA還原酶(Hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase)；MK.甲羥戊酸激酶(Meval-onate kinase)；PMK.二氧磷基MVA激酶(Phosphomevalonate kinase)；MVD.甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase)；IDI.異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(Lisopentenyl diphosphate isomerase)；FPPS.法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；SS.鯊烯合成酶(Squalene synthetase)；SE.鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase)；OSC.氧鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene cyclases)；LS.羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase)；DS.達(dá)瑪烯合成酶(Dammarenediol synthase)；CS.葫蘆二烯醇合酶(Cucurbitadienol synthase)；CAS.環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase)；PS.帕克醇合酶(Parkeol synthase)；OS.秈稻醇合酶(Orysatinol synthase)；β-AS.β-香樹素合成酶(β-Amyrin synthase)；LUS.羽扇醇合成酶(Lupeol synthase)；α-AS.α-香樹脂醇合成酶(α-Amyrin synthase)；FS.木栓酮合成酶(Friedelane synthase)

本文歸納總結(jié)了植物中合成各種三萜類碳骨架的OSC和對(duì)三萜不同位點(diǎn)修飾的CYP450的研究進(jìn)展，以期為深入探索OSC和CYP450在三萜類成分生物合成中的功能研究提供基礎(chǔ)。

1 OSC基因家族主要成員及其研究進(jìn)展

OSC屬于一個(gè)超家族，家族成員具有DCTAE和QW高度保守序列。其中，DCTAE序列與底物結(jié)合有關(guān)；4個(gè)重復(fù)的帶有負(fù)電性的芳香族氨基酸QW(QXXXXXW)序列在2,3-氧化鯊烯環(huán)化反應(yīng)中起到穩(wěn)定碳正離子的作用。

在植物合成三萜類成分的過程中，2,3-氧化鯊烯在OSC作用下，發(fā)生環(huán)化反應(yīng)的過程中會(huì)形成“椅-椅-椅”(C-C-C)和“椅-船-椅”(C-B-C)2種不同的空間構(gòu)象，其環(huán)化主要涉及4個(gè)步驟：①結(jié)合底物并預(yù)先確定環(huán)系統(tǒng)；②通過環(huán)氧化物的質(zhì)子化引發(fā)反應(yīng)；③碳正離子物種的環(huán)化和重排；④通過去質(zhì)子化或脫水生成最終的三萜類產(chǎn)物。從提出的氧化角鯊烯環(huán)化機(jī)理來看，產(chǎn)物的多樣性主要取決于環(huán)化反應(yīng)中穩(wěn)定碳正離子的能力[10]。

迄今為止，已經(jīng)從不同植物中分離得到10種OSC酶，分別為：羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase，LS)、達(dá)瑪烯合成酶(Dammarenediol synthase，DS)、葫蘆二烯醇合成酶(Cucurbitadienol synthase，CS)、環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase，CAS)、帕克醇合成酶(Parkeol synthase，PS)、秈稻醇合成酶(Orysatinol synthase，OS)、β-香樹素合成酶(β-Amyrin synthase，β-AS)、羽扇醇合成酶(Lupeol synthase，LUS)、α-香樹脂醇合成酶(α-Amyrin synthase，α-AS)和木栓酮合成酶(Friedelane synthase，F(xiàn)S)。在三萜的生物合成途徑中，代謝支路都源于2,3-氧化鯊烯這個(gè)共同前體物質(zhì)。

1.1 羊毛甾醇合成酶(LS)

LS可催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成甾醇和羊毛脂甾烷型三萜的前體物質(zhì)羊毛甾醇(Lanosterol)[11]，該酶通過催化2,3-氧化鯊烯排列成“C-B-C”的構(gòu)象，產(chǎn)生C-30原甾醇陽離子中間體，進(jìn)一步催化形成羊毛甾醇[11]。隨后羊毛甾醇在植物體內(nèi)經(jīng)過一系列的反應(yīng)產(chǎn)生具有羊毛甾醇骨架的三萜和植物甾醇，LS的含量以及其活性高低可間接地影響到三萜類成分的含量。研究人員已在擬南芥、靈芝等植物中進(jìn)行LS基因克隆和表達(dá)的研究[11-12]。

Zhang等克隆了靈芝中Gl-LS基因并構(gòu)建過表達(dá)的靈芝菌株，發(fā)現(xiàn)Gl-LS基因的過表達(dá)可促進(jìn)靈芝酸Mk、靈芝酸T、靈芝酸O等多種靈芝酸的產(chǎn)生，含量增加2.0～6.1倍，同時(shí)也使羊毛甾醇的含量提高2.3倍，該結(jié)果表明Gl-LS基因的上調(diào)表達(dá)可有效促進(jìn)羊毛甾醇含量的積累，從而促進(jìn)靈芝酸類三萜成分的合成[13]。

1.2 達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)

DS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成達(dá)瑪烯二醇Ⅱ(Dammarenediol Ⅱ)，再經(jīng)過CYP450等的作用進(jìn)一步反應(yīng)生成達(dá)瑪烷型三萜類成分。在人參、三七、西洋參等植物中均有關(guān)于DS的相關(guān)報(bào)道[14-15]。

Lu等通過瞬時(shí)過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)人參中PgDS基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子PgMYB2正調(diào)控作用，同時(shí)植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)顯著誘導(dǎo)PgDS基因和PgMYB2的表達(dá)水平[14]。梁會(huì)超等運(yùn)用同源堿基PCR方法得到DS-Ⅱ的cDNA序列，并在酵母中進(jìn)行表達(dá)，通過體外酶促實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有大量的達(dá)瑪烯二醇合成[15]。

1.3 葫蘆二烯醇合成酶(CS)

在葫蘆烷型化合物生物合成途徑中，CS催化底物2,3-氧化鯊烯形成葫蘆二烯醇(Cucurbitadienol)。葫蘆二烯醇是葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，為羅漢果甜苷和葫蘆素等重要中藥有效成分生物合成途徑中的基本前體[16]，它的存在及其含量影響著下游產(chǎn)物的種類及含量。目前已經(jīng)在羅漢果、西葫蘆、黃瓜、藥西瓜等植物中有CS的相關(guān)研究報(bào)道[17-18]。Jing等通過對(duì)羅漢果中CS基因進(jìn)行全面的SNP分析和誘變實(shí)驗(yàn)，成功地確定了決定CS活性的50和573位的2個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[17]。Davidovich-Rikanati等克隆得到藥西瓜中的CcCDS1和CcCDS2序列，采用酵母菌株BY4743進(jìn)行功能驗(yàn)證，經(jīng)LC-TOF-MS檢測發(fā)現(xiàn)只有CcCDS2具有CS活性，其酵母表達(dá)產(chǎn)物中含有葫蘆二烯醇[18]。

1.4 環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)

CAS催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成環(huán)阿屯醇(Cycloartenol)，在甾醇類化合物的合成途徑中起著關(guān)鍵調(diào)控元件的作用。在目前的研究中已經(jīng)從20多種植物中克隆出了其cDNA的序列。研究人員對(duì)三七、杠柳、羅漢果等植物進(jìn)行了CAS的克隆、表達(dá)以及生物信息學(xué)的分析[19-20]。CAS和β-AS具有共同的前體物，兩者之間可進(jìn)行競爭從而影響代謝產(chǎn)物。

1.5 帕克醇合成酶(PS)和秈稻醇合成酶(OS)

在水稻中發(fā)現(xiàn)了粳稻PS和OS，PS能夠催化2,3-氧化鯊烯形成“C-B-C”構(gòu)象，生成具有四環(huán)三萜特征的帕克醇(parkeol)，OS則催化2,3-氧化鯊烯形成一種新的“椅-半椅-椅(C-sC-C)”構(gòu)象，產(chǎn)生五環(huán)三萜秈稻醇(Orysatinol)的主產(chǎn)物及12種不同的三萜類成分[21]。目前，PS和OS僅在水稻中有報(bào)道，漆小泉團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)絕大部分秈稻和野生稻具有OS的催化功能，而PS是粳稻馴化過程中由其近緣野生稻新產(chǎn)生的單功能三萜環(huán)化酶。利用分子進(jìn)化分析、蛋白結(jié)構(gòu)模擬、定點(diǎn)突變和催化功能分析，發(fā)現(xiàn)124、365、732這3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基能夠影響第4個(gè)氨基酸殘基(Tyr257)的空間方向，從而決定了產(chǎn)物是四環(huán)三萜帕克醇還是五環(huán)三萜秈稻醇，為揭示形成船式和椅式三萜骨架的催化機(jī)制提供基礎(chǔ)[21]。

1.6 β-香樹素合成酶(β-AS)

β-AS是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的一種催化齊墩果烷型三萜生物合成的關(guān)鍵酶，其催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成β-香樹脂烷(β-Amyrin)，在此催化過程中2,3-氧化鯊烯以“C-C-C”的構(gòu)象形成達(dá)瑪脂陽離子，再通過重排和質(zhì)子化作用生成齊墩果烷型三萜。有研究認(rèn)為在β-AS中還存在MWCYCR保守序列，該保守序列中的色氨酸可能對(duì)三萜類物質(zhì)骨架的生成起重要作用[22]。

β-香樹脂烷是這類β-香樹脂烷型三萜類化合物生物合成的共同前體，這類物質(zhì)包括甘草酸、山楂酸等化合物[23]。多個(gè)β-AS基因已在人參、甘草、擬南芥、珠子參、青蒿等植物中被克隆驗(yàn)證[24-25]。隨著研究的深入，β-AS的同源基因在不同植物中已發(fā)現(xiàn)超過300余條。Yin等在白樺樹中得到編碼Bpβ-AS的全長cDNA，并通過反向遺傳學(xué)鑒定其在樺木的三萜合成中的功能，發(fā)現(xiàn)Bpβ-AS基因的抑制能夠正向調(diào)節(jié)樺木酸的合成[24]。Liu等從麻花秦艽中分離得到編碼β-AS的GsAS1和GsAS2，通過酵母異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GsAS2產(chǎn)生的β-香樹脂烷產(chǎn)量要多于GsAS1，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GsAS2催化齊墩果酸積累的效率是GsAS1的1.9倍，表明GsAS2在麻花秦艽中的齊墩果酸生物合成中起著比GsAS1更重要的作用[25]。

1.7 羽扇豆醇合成酶(LUS)

LUS催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成羽扇豆醇(Lupeol)。在催化過程中，2,3-氧化鯊烯形成“C-C-C”構(gòu)象的排列，產(chǎn)生四環(huán)素達(dá)瑪陽離子中間體，進(jìn)一步生成羽扇豆陽離子，最終生成羽扇豆醇?，F(xiàn)有的研究表明羽扇豆醇在抗腫瘤方面具有很好的效果[26]。

已有多種來源于不同物種的LUS通過異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證，如來源于甘草的LUS[27]，來源于栓皮櫟的LUS[28]，來源于蓖麻的RcLUS[29]等。在三萜合酶中，LUS和β-AS在四環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為五環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)子重排過程中的關(guān)鍵位點(diǎn)具有相同的芳香族保守殘基。

1.8 α-香樹脂醇合成酶(α-AS)

α-AS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)形成α-香樹脂醇(α-Amyrin)。α-香樹脂醇是植物當(dāng)中重要的五環(huán)三萜，具有重要的生理和藥理活性。Li等克隆了枇杷和蘋果中的α-AS，并在酵母中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)枇杷中的α-AS以17∶3的比例產(chǎn)生α-香樹脂醇和β-香樹脂醇，蘋果中的α-AS以86∶13∶1的比例產(chǎn)生α-香樹脂醇，β-香樹脂醇和羽扇豆醇[30]。Pisanee等通過釀酒酵母的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)巴西羊蹄甲中的α-AS2能夠以高達(dá)90%的比例催化2,3-氧化鯊烯轉(zhuǎn)化為α-Amyrin，這是豆科植物中第1個(gè)被報(bào)道的合成α-香樹脂醇的α-AS[31]。

1.9 木栓酮合成酶(FS)

FS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應(yīng)形成木栓酮(Friedelane)，屬于木栓烷型五環(huán)三萜類化合物。FS目前在雷公藤、山楊等植物中有報(bào)道[32]。Zhou等通過同源堿基PCR方法成功得到了雷公藤中FS1和FS3的cDNA序列，并在酵母中進(jìn)行表達(dá)，通過UPLC分析發(fā)現(xiàn)生成木栓酮，進(jìn)一步通過底物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)木栓酮參與雷公藤紅素的生物合成[32]。

2 參與三萜生物合成的細(xì)胞色素P450(CYP450)研究現(xiàn)狀

CYP450是一個(gè)古老的超基因家族，同時(shí)也是植物代謝中最大的酶家族。CYP450具有廣泛的催化活性，最常見反應(yīng)是單加氧酶反應(yīng)，其催化的三萜碳骨架修飾顯著促進(jìn)三萜類成分的結(jié)構(gòu)多樣性。CYP450是根據(jù)氨基酸的同源性來進(jìn)行分類，同源性大于40%歸為同一基因家族，同源性大于55%則歸為同一亞家族[33]。目前，植物中已有127個(gè)CYP450家族被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹上的分類，又被分為11個(gè)簇，其中CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746為單家族簇，CYP71、CYP72、CYP85、CYP86為多家族簇[34]。但是CYP450的分類只能代表系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，與其所屬功能無必然聯(lián)系。特異性調(diào)控三萜類成分生物合成的CYP450基因主要?dú)w屬于CYP51、CYP71、CYP72、CYP85家族[35]。

2.1 CYP51家族

CYP51家族是最古老，最保守的真核CYP450家族之一。其中，CYP51H亞家族是該家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一參與三萜類骨架修飾的亞家族，屬于單子葉植物特有的P450亞家族，進(jìn)行五環(huán)三萜的骨架修飾。在燕麥中，CYP51H10對(duì)于燕麥毒素(齊墩果烷型三萜皂苷)的合成是必不可少的，其能催化β-香樹脂醇形成12,13β-環(huán)氧-16β-羥基-β-香樹脂醇，包括2個(gè)連續(xù)反應(yīng)：首先是β-香樹脂醇的C-16位發(fā)生羥基化反應(yīng)，形成16β-羥基-β-香樹脂醇，進(jìn)一步在C環(huán)上的C-12/C-13位發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)[36]。

2.2 CYP71家族

CYP71家族是植物CYP450中最大的家族，其中CYP71A、CYP71D、CYP81Q、CYP89A、CYP93E和CYP705A亞家族參與三萜類成分的結(jié)構(gòu)修飾。

目前關(guān)于CYP71A亞家族的CYP450基因報(bào)道還僅限于擬南芥中的CYP71A16，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CYP71A16與OSC(MRN1)同時(shí)在酵母中表達(dá)時(shí)，C-23位會(huì)發(fā)生羥基化反應(yīng)，通過分析擬南芥CYP71A16突變體系和過表達(dá)體系的結(jié)果，證實(shí)CYP71A16在三萜中的氧化作用[37]。

CYP71D353是CYP71D亞家族參與三萜生物合成的唯一成員，其他CYP71D亞族成員主要參與單萜和類黃酮羥基化。日本金蓮花中的CYP71D353具有氧化羽扇豆烷型五環(huán)三萜的功能，催化二氫羽扇豆醇C-20位進(jìn)行羥基化反應(yīng)生成20-羥基羽扇豆醇[38]。CYP71D353還被證實(shí)可以將20-羥基羽扇豆醇的C-28位依次進(jìn)行三步氧化后轉(zhuǎn)化為20-羥基白樺脂酸[38]。

利用酵母單雜交和RNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃瓜中CYP81Q58、CYP81Q59、CYP89A140均參與葫蘆素C的生物合成[39]，CYP81Q58可以氧化19-羥基葫蘆二烯醇的C-25位生成19,25-二羥基葫蘆二烯醇。在西瓜和甜瓜中還發(fā)現(xiàn)了與葫蘆素B和葫蘆素E生物合成相關(guān)的CYP81Q59，將CYP81Q59轉(zhuǎn)入產(chǎn)11-羰基-20β-羥基葫蘆二烯醇的工程菌中驗(yàn)證其催化功能，證實(shí)CYP81Q59能氧化11-羰基-20β-羥基-葫蘆二烯醇的C-2位生成11-羰基-2β,20β-二羥基-葫蘆二烯醇[39]。

目前發(fā)現(xiàn)的CYP93E的亞家族成員僅限于豆類植物中三萜的生物合成，催化三萜骨架的C-24位氧化。大豆中發(fā)現(xiàn)的CYP93E1可將β-香樹脂醇和槐葉二醇分別轉(zhuǎn)化為24-羥基-β-香樹脂醇和大豆皂醇B[40]。CYP93E1也代表三萜生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)CYP93E亞家族的P450。在紫花苜蓿中，CYP93E2能夠催化β-香樹脂醇的C-24羥基化。同樣，甘草中發(fā)現(xiàn)的CYP93E3在β-香樹脂醇的C-24發(fā)揮羥基化作用。迄今為止，從8個(gè)豆科植物物種中鑒定出另外9個(gè)CYP93Es[41]。

CYP705A的亞家族成員目前僅在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，其中CYP705A1能夠催化裂解擬南芥比醇的側(cè)鏈獲得14-apo-擬南芥比醇[42]。

2.3 CYP72家族

在植物中，CYP72是促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物生成的最大酶類之一，其中CYP72A亞家族成員被證實(shí)參與三萜骨架的修飾。Liu等在歐洲山芥中獲得CYP72A522，通過體外酶促反應(yīng)證實(shí)CYP72A522可以催化齊墩果酸的C-23位發(fā)生羥基化反應(yīng)[43]。研究顯示，苜蓿中的CYP72A61，CYP72A63，CYP72A67和CYP72A68參與齊墩果烷型三萜骨架的氧化反應(yīng)。CYP72A61的功能被證實(shí)為C22-羥化酶，將24-羥基-β-香樹脂醇轉(zhuǎn)化為大豆皂酚B[44]。CYP72A67和CYP72A68分別為C2β-羥化酶(齊墩果酸)和C23-氧化酶(齊墩果酸)[45]。烏拉爾甘草中的CYP72A154是C30-氧化酶，催化11-氧代-β-香樹脂醇發(fā)生三步氧化反應(yīng)形成甘草次酸，參與甘草甜素的合成[46-47]。同時(shí)，體外酶促實(shí)驗(yàn)和酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)CYP72A154為多功能酶，能氧化D環(huán)和E環(huán)上不同位置的碳原子，與甘草中三萜類成分的多樣性密切相關(guān)。CYP72A154也可氧化β-香樹脂醇的C-30位生成30-羥基-β-香樹脂醇[48]。在蒺藜草中發(fā)現(xiàn)的CYP72A63也具有C30-氧化酶活性，并且在三步氧化后將β-香樹脂醇轉(zhuǎn)化為11-脫氧甘草次酸[49]。

2.4 CYP85家族

CYP85是一個(gè)多家族簇，其中的CYP88、CYP716、CYP87、CYP708參與三萜結(jié)構(gòu)修飾。

在甘草酸途徑中，CYP88D6催化β-香樹脂醇的C-11位發(fā)生連續(xù)兩步氧化反應(yīng)，產(chǎn)生11-氧代-β-香樹脂醇[27]。在擬南芥三環(huán)三萜類成分生物合成中，CYP708A2能夠催化擬南芥醇(Thalianol)形成7β-羥基擬南芥醇[42]。

CYP716被歸類為CYP85，大多數(shù)的CYP716參與五環(huán)三萜骨架的修飾[33]。從超過200種植物中收集到的關(guān)于CYP716的進(jìn)化分析報(bào)告顯示，CYP716家族主要參與三萜的生物合成，其中CYP716A、CYP716C、CYP716E、CYP716S、CYP716U和CYP716Y等亞家族已被證實(shí)能催化三萜的生物合成。

迄今為止，大約20種CYP716A的特征是具有香樹脂醇/羽扇豆醇的C28-氧化酶的活性。這些CYP716As中的大多數(shù)催化香樹脂醇/羽扇豆醇骨架的連續(xù)三步氧化反應(yīng)，導(dǎo)致C-28位置連續(xù)形成羥基，醛和羧基部分[50]。Tamura發(fā)現(xiàn)CYP716A179為多功能酶，將CYP716A179在酵母工程菌中異源表達(dá)，結(jié)果表明CYP716A179為C-28位氧化酶，其能氧化α-香樹脂醇、β-香樹脂醇及羽扇豆醇的C-28位分別生成烏蘇酸、齊墩果酸和樺木酸[51]。

Park等采用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CYP716A47和CYP716A53v2進(jìn)行功能研究，CYP716A47為原人參二醇合酶，能夠氧化達(dá)瑪烯二醇的C-12位生成原人參二醇，CYP716A53v2則進(jìn)一步氧化原人參二醇的C-6位生成原人參三醇[52]。CYP716A47和CYP716A53v2參與達(dá)瑪烷型三萜生物合成過程中2個(gè)連續(xù)的氧化反應(yīng)。研究人員還利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法在煙草中共表達(dá)人參達(dá)瑪烯二醇合酶(PgDDS)、CYP716A47和CYP716A53v2，在轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中檢測到達(dá)瑪烯二醇、原人參二醇和原人參三醇，在煙草體系中進(jìn)一步驗(yàn)證了PgDDS、CYP716A47和CYP716A53v2的功能[53]。Han等通過酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CYP716A52v2進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)其具有β-香樹脂醇C28-氧化酶活性，能夠氧化β-香樹脂醇的C-28位生成齊墩果酸[54]。Dai等將人參中的β-香樹脂醇合酶、CYP716A53v2、CYP716A52v2與PgDDS、CYP716A47同時(shí)導(dǎo)入酵母中，獲得了能同時(shí)產(chǎn)生原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸3種人參皂苷苷元的酵母工程菌[55]。少數(shù)植物CYP716A還靶向除C28以外的香樹脂醇骨架的碳原子，比如擬南芥中CYP716A2為C22α羥基化，桔梗中CYP716A141為C16β羥基化，青蒿中CYP716A14v2為C3氧化。

Miettinen等發(fā)現(xiàn)積雪草中CYP716C11可以催化齊墩果酸，6β-羥基油醇酸和熊果酸的C2α羥基化[56]。番茄CYP716E26和積雪草CYP716E41的催化特征為C6β-羥化酶，催化底物分別為α/β-香樹脂醇和齊墩果酸/熊果酸[57]。

桔梗中CYP716S5能夠催化β-香樹脂醇生成12,13α-環(huán)氧-β-香樹脂醇，12,13α-環(huán)氧齊墩果酸和12α-羥基-β-香樹脂醇-13,28β-內(nèi)酯[56]，其中12,13α-環(huán)氧齊墩果酸可自發(fā)形成12α-羥基-β-香樹脂醇-13,28β-內(nèi)酯，說明CYP716S5能催化β-香樹脂醇及齊墩果酸的C-12,13α環(huán)氧化反應(yīng)及某一位置的羥基化。

人參CYP716U1和CYP716S1v2在人參的生物合成途徑中催化2個(gè)連續(xù)的羥化反應(yīng)[58]。CYP716U1參與達(dá)瑪烯二醇的C-12位羥基化，產(chǎn)生原人參二醇。CYP716S1v2催化原人參二醇C-6位羥基化產(chǎn)生原人參三醇。此外，柴胡中CYP716Y1是一種C16α-羥化酶，對(duì)β-香樹脂醇和α-香樹脂醇骨架具有修飾作用[59]。

CYP87D是CYP85家族除CYP88D、CYP708A和CYP716s外的另一個(gè)亞家族。杉木中的CYP87D16是目前發(fā)現(xiàn)與五環(huán)三萜骨架修飾相關(guān)的唯一CYP87D亞家族成員。CYP87D16通過催化β-香樹脂醇C16α-羥基化參與三萜合成。羅漢果中發(fā)現(xiàn)的CYP87D18是1個(gè)多功能酶，對(duì)葫蘆二烯醇、24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇和24,25-二羥基葫蘆二烯醇的C-11位均具有氧化活性。Zhang等將酵母中表達(dá)的CYP87D18與葫蘆二烯醇進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP87D18能連續(xù)氧化葫蘆二烯醇的C-11位生成11-羥基葫蘆二烯醇和11-羰基葫蘆二烯醇[60]。

3 結(jié)語與展望

綜上，OSC在三萜類成分的生物合成中能催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化形成不同類型的碳骨架，是三萜類成分多樣性的基礎(chǔ)，為三萜類成分的生物合成提供重要的先導(dǎo)化合物。CYP450則參與植物三萜類成分的骨架修飾，催化三萜骨架空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性氧化，形成各種官能團(tuán)，最終產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異的三萜類成分。因CYP450數(shù)量龐大且催化功能多樣，既可以催化不同底物的同一位點(diǎn)，也可以催化同一底物的不同位點(diǎn)，這些功能豐富的CYP450的發(fā)現(xiàn)對(duì)于催化機(jī)制的研究具有重要意義。目前植物三萜類成分生物合成途徑的研究已有一定的進(jìn)展，但三萜骨架構(gòu)建和修飾的研究，因三萜類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜及修飾酶基因種類繁多，具體合成步驟還未清楚。利用合成生物學(xué)的方法合成三萜類成分還需對(duì)其碳環(huán)骨架建立以及復(fù)雜的官能團(tuán)反應(yīng)進(jìn)行深入研究。目前通過序列同源性較高或者化合物結(jié)構(gòu)相似的方法研究OSC和CYP450功能只能起到簡單的預(yù)測作用，進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是明確其催化作用的有效方法。因此，進(jìn)一步開展OSC和CYP450的克隆及催化功能研究，為解析三萜類成分生物合成中關(guān)鍵酶的功能研究提供思路，最終為通過基因調(diào)控實(shí)現(xiàn)不同單體三萜的異源合成奠定基礎(chǔ)。