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    基于“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)和分子對(duì)接技術(shù)的瀉火消癭方治療格雷夫斯病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制初探

    2021-03-31 09:28:56崔國(guó)倩項(xiàng)艷曲曉洋相萍萍朱粉霞謝亞萍
    關(guān)鍵詞:消癭瀉火知母

    崔國(guó)倩,項(xiàng)艷,曲曉洋,相萍萍,朱粉霞,謝亞萍

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210028)

    格雷夫斯病(Graves diseases,GD),亦稱彌漫性毒性甲狀腺腫,是一種體內(nèi)甲狀腺激素分泌增多的自身免疫性代謝疾病[1],以彌漫性甲狀腺腫和分泌功能亢進(jìn)為主要特征,為甲狀腺功能亢進(jìn)癥(簡(jiǎn)稱甲亢)最常見的類型,約占甲亢的85%[2]。近年來(lái),該病呈患病率逐年增多和起病年輕化的趨勢(shì)[3-5],還與許多潛在的致命疾病如心臟衰竭、心肌梗死、中風(fēng)等密切相關(guān),甚至?xí)黾幼詺⒓叭蛩劳鲲L(fēng)險(xiǎn)[6-8]。

    中醫(yī)根據(jù)GD的臨床癥狀,可將其歸屬于“癭氣”和“癭病”的范疇。關(guān)于GD的發(fā)病病機(jī),雖各方醫(yī)家持有不同觀點(diǎn),但多認(rèn)為肝郁及陰虛為其主要病因[9]。臨床表現(xiàn)主要以臟腑氣血功能失調(diào)、肝氣郁結(jié)、經(jīng)脈氣機(jī)阻遏,內(nèi)郁日久而生痰化火、耗損陰津,最終痰氣郁結(jié)交互阻于頸項(xiàng)而發(fā)癭瘤[2]。

    GD的臨床治療主要包括抗甲狀腺藥物(Antithyroid drugs,ATDs)、放射性治療和手術(shù)治療,但普遍存在緩解率低、復(fù)發(fā)率高、長(zhǎng)期療效不理想、并發(fā)癥多等問題[10]。為此,尋求更有效的治療方法和藥物迫在眉睫。

    瀉火消癭方是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院應(yīng)用多年的臨床協(xié)定經(jīng)驗(yàn)方,其組成為龍膽、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母及穿山龍[11],是在龍膽瀉肝湯的基礎(chǔ)上化裁凝練而成,具有清肝瀉火、滋陰寧心的功效。在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方有助于GD患者甲狀腺功能迅速恢復(fù),提高疾病恢復(fù)率,減少ATDs的應(yīng)用[12],但其治療GD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和具體機(jī)制并不清楚,有待進(jìn)一步闡明。

    本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選、預(yù)測(cè)和查找瀉火消癭方的活性化學(xué)成分和作用靶點(diǎn),構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)、靶點(diǎn)功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而用分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證,揭示瀉火消癭方治療GD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)(圖1)。

    圖1 研究思路

    1 材料與方法

    1.1 瀉火消癭方中化學(xué)成分的收集

    借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com)和CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cnki.net/),收集瀉火消癭方中龍膽草、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母、穿山龍7味藥材的化學(xué)成分。以口服吸收利用度(Oral bioavailability,OB)≥20%,藥物相似性(Drug likeness,DL)≥0.18作為參數(shù)進(jìn)行篩選,獲取瀉火消癭方的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集。進(jìn)而通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得每個(gè)化合物的2D結(jié)構(gòu)集;再使用Chem3D 19.0將其轉(zhuǎn)化成mol2文件。利用Discovery Studio(DS)2016軟件對(duì)瀉火消癭方中化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理,從而生成瀉火消癭方中化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。

    1.2 瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)篩選

    基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(www.swisstargetprediction.ch/),以Probability值>0.5為參數(shù)篩選靶點(diǎn),同時(shí)結(jié)合DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn)提供的靶點(diǎn)信息,反向預(yù)測(cè)瀉火消癭方中化學(xué)成分所作用的潛在靶點(diǎn)。將各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果取并集,并刪除重復(fù)結(jié)果,最終獲得瀉火消癭方中化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)集。

    以“Graves diseases”為關(guān)鍵詞,在TTD(http://bidd.nus.edu.sg/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得GD疾病相關(guān)靶點(diǎn)集。

    將以上篩選出的瀉火消癭方化學(xué)成分作用靶點(diǎn)集,與尋獲的GD相關(guān)疾病靶點(diǎn)集取交集,即獲得瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)集。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將交集靶點(diǎn)規(guī)范為人源(Homo Sapiens)的標(biāo)準(zhǔn)基因,作為靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化名稱。

    1.3 “藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    標(biāo)識(shí)以上靶點(diǎn)集對(duì)應(yīng)屬性,導(dǎo)入Cytoscape3.6.1構(gòu)建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。再將瀉火消癭方中化學(xué)成分的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/),物種選擇“Homo Sapiens”,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

    1.4 靶點(diǎn)通路注釋分析

    為進(jìn)一步分析瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)集的基因功能以及在信號(hào)通路中的作用,將其官方簡(jiǎn)稱上傳到Matescape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/),設(shè)定閾值P<0.01,同時(shí)Background選擇“Homo Spanies”,經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作,分別進(jìn)行蛋白的GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析,并對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理[13]。

    1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

    利用DS 2016軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模型,進(jìn)而與瀉火消癭方中篩選出的主要活性化合物,進(jìn)行分子對(duì)接,分析對(duì)接結(jié)果。并與GD陽(yáng)性藥分子比較,驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的可靠性。首先在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載瀉火消癭方活性化學(xué)成分治療GD關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu),選擇人源受體、解析度小于2.5 ?并具有配體的蛋白復(fù)合物,以保證對(duì)接的精度。采用DS 2016中CleanProtein工具對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)處理,根據(jù)PDB晶體原配體的空間位置定義活性口袋,Conformation method參數(shù)設(shè)置為“Best”,Docking preferences參數(shù)設(shè)置為“High quality”,其余參數(shù)為默認(rèn)。將原配體抽出后重新對(duì)接到蛋白的活性口袋中,根據(jù)對(duì)接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差(RMSD)大小判斷對(duì)接程序參數(shù)設(shè)置的合理性以及對(duì)該晶體復(fù)合物的實(shí)用性,一般認(rèn)為當(dāng)RMSD≤2 ?時(shí)說(shuō)明分子對(duì)接模型能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結(jié)合模式,對(duì)接結(jié)果有較高的可靠性[14]。再將瀉火消癭方中潛在活性成分及抗GD陽(yáng)性藥分子導(dǎo)入DS 2016中進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算對(duì)接打分值(-CDOCKER ENERGY)。

    當(dāng)-CDOCKER ENERGY值高于原配體時(shí),可認(rèn)為成分與靶點(diǎn)具有較高的結(jié)合活性,以此作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià),并與陽(yáng)性藥分子的-CDOCKER ENERGY值對(duì)比。

    2 結(jié)果

    2.1 化合物及靶蛋白篩選結(jié)果

    通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到多個(gè)化合物(符合條件OB≥20%,DL≥0.18),其中龍膽含有17個(gè)成分,夏枯草含有16個(gè)成分,黃芩含有36個(gè)成分,百合含有9個(gè)成分,知母含有15個(gè)成分以及穿山龍含有4個(gè)成分成分。對(duì)于生地黃,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)不能檢索到其化合物,我們通過查閱文獻(xiàn),得到生地黃中的化學(xué)成分[15-17],進(jìn)而在TCMSP網(wǎng)站中查看其OB值和DL值,最終有7個(gè)化學(xué)成分符合條件,因此,選擇這7個(gè)化合物作為生地黃的主要成分。知母中的芒果苷和知母皂苷BⅡ是2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的指標(biāo)性成分,但是在TCMSP網(wǎng)站中未檢索到芒果苷的OB值和DL值,檢索到知母皂苷BⅡ的OB值和DL值分別為3.11和0.04,因其比較重要,亦將其添加上[18]。去掉7個(gè)重復(fù)成分(齊墩果酸、異葒草素、β-谷甾醇、山柰酚、西托糖苷、植物甾醇和豆甾醇葡萄糖苷)。因此,共確定瀉火消癭方化學(xué)成分92個(gè)。

    收集到的化學(xué)成分較多,因此對(duì)其進(jìn)行一個(gè)分類分析。圖2的圓環(huán)圖表明,瀉火消癭方中化學(xué)成分主要集中在黃酮類,其次分別是萜類、甾體和生物堿等。

    圖2 瀉火消癭方中化學(xué)成分的主要結(jié)構(gòu)類型

    2.2 瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD潛在作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

    在DrugBank、PharmMapper及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)上傳92個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息,獲取其作用靶點(diǎn),將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的人源靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn),最終獲得與瀉火消癭方化學(xué)成分相關(guān)的人源靶點(diǎn)1 154個(gè)。

    以“Graves diseases”為關(guān)鍵詞,利用TTD、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索,去重以后共獲得GD相關(guān)靶點(diǎn)1 467個(gè)。

    將瀉火消癭方中化學(xué)成分作用的1 154個(gè)潛在作用靶點(diǎn)映射到1 467個(gè)GD靶點(diǎn)集中,最終獲得瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)為227個(gè)(圖3)。其中君藥龍膽化學(xué)成分共占154個(gè)靶點(diǎn),臣藥夏枯草和黃芩分別占121、160個(gè)靶點(diǎn),佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個(gè)靶點(diǎn)。

    圖3 瀉火消癭方反向找靶及治療GD潛在作用靶點(diǎn)研究

    2.3 構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

    借用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,可以直觀顯示7味中藥成分和靶點(diǎn)的關(guān)系及其重要性。如圖4所示,圖中共有326個(gè)節(jié)點(diǎn),2 924條網(wǎng)絡(luò)。度值(Degree)是指連接該節(jié)點(diǎn)的邊的數(shù)量,連接該點(diǎn)的邊越多,度值越大,說(shuō)明與該點(diǎn)相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)越復(fù)雜[13]。在軟件中設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小與顏色反映Degree的變化,節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深,則Degree越大,從而構(gòu)建瀉火消癭方對(duì)GD的潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

    從圖4可看出,成分中Degree最大的是植物甾醇(E1,Degree=132),其次是西托糖苷(D1,Degree=120)、β-谷甾醇(B1,Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(F1,Degree=80)、山柰酚(C1,Degree=72)、齊墩果酸(A1,Degree=68)和異葒草素(A2,Degree=65),均為重復(fù)成分。以Degree為依據(jù)進(jìn)行靶點(diǎn)排序,前15位靶點(diǎn)分別為CA2、CA1、ESR2、MET、EGFR、SRC、FLT3、PTGS2、ESR1、ABCB1、IGF1R、MMP9、MMP3、PIK3CG、NOX4。

    圖4 瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

    2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

    將篩選出的227個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI表。利用Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,同時(shí)利用Cytoscape模塊分析功能進(jìn)行聚類分析,從而得到最佳模塊。如圖5所示,將最佳功能模塊分為模塊一(MCODE-1)、模塊二(MCODE-2)、模塊三(MCODE-3)、模塊四(MCODE-4)、模塊五(MCODE-5)、模塊六(MCODE-6)。

    圖5 瀉火消癭方干預(yù)GD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

    網(wǎng)絡(luò)中PPI靶點(diǎn)有227個(gè),2 935條邊代表了蛋白之間相互作用關(guān)系。通過10種計(jì)算方法(MCC、Degree、MNC、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress),選出各方法計(jì)算出的前50位靶點(diǎn),并取其交集,分別是EGFR、SRC、JUN、HSP90AA1、TP53、HSPA1A、MAPK3、GRB2、STAT3、ESR1、MAPK14、PIK3R1、CTNNB1、HPSAS、HDAC1、PARP1、HDAC2、CCND1,推測(cè)以上18個(gè)靶點(diǎn)可能是瀉火消癭方治療GD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

    2.5 模塊化分析

    再將獲得的227個(gè)瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),應(yīng)用分子復(fù)合物檢測(cè)(MCODE)算法來(lái)識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò),按照P值將PPI網(wǎng)絡(luò)劃分得到最佳功能模塊,具體結(jié)果如圖6。

    圖6 PPI模塊分析

    其中MCODE-1為圖7中的紅色節(jié)點(diǎn),主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway);MCODE-2為圖7中的藍(lán)色節(jié)點(diǎn),主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer);MCODE-3為圖7中綠色節(jié)點(diǎn),主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction);MCODE-4為圖7中紫色節(jié)點(diǎn),主要參與甲型流感(Influenza A);MCODE-5為圖7中橙色節(jié)點(diǎn),主要參與胰島素抵抗(Insulin resistance)、mTOR信號(hào)通路(mTOR signaling pathway);MCODE-6為圖7中黃色節(jié)點(diǎn),主要參與TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)。

    圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)

    2.6 靶蛋白生物分析結(jié)果

    通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)瀉火消癭方與GD交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析和GO富集分析,獲得靶基因參與的通路和生物過程。結(jié)果顯示,通過對(duì)成分靶蛋白進(jìn)行生物分析,共得到KEGG通路192條(P<0.05),根據(jù)通路P值,結(jié)合生物學(xué)信息,選取P值相對(duì)較小且靶點(diǎn)富集的20條生物學(xué)過程。

    以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中富集得到的通路信息繪制KEGG通路氣泡圖,結(jié)果見圖8。發(fā)現(xiàn)癌癥通路(Pathways in cancer)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)、利什曼病(Leishmaniasis)、人T細(xì)胞白血病病毒1感染(Human T-cell leukemia virus 1 infection)等生物學(xué)過程,在瀉火消癭方治療GD中發(fā)揮重要作用。

    圖8 KEGG富集分析氣泡圖

    將KEGG富集結(jié)果與瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行結(jié)合,構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò),結(jié)果如圖9所示,其中粉紫色正方形代表信號(hào)通路,大小代表-logP值。

    圖9 瀉火消癭方成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

    GO功能富集分析得到GO條目2 385個(gè)(P<0.05),其中生物過程(BP)條目1 988個(gè),細(xì)胞組成(CC)條目255個(gè),分子功能(MF)條目142個(gè),選取P值相對(duì)較小且靶點(diǎn)富集的20條BP條目繪制GO條目柱狀圖,如圖10所示。BP富集到的條目主要為細(xì)胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to organic cyclic compound)、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控(Regulation of MAPK cascade)、對(duì)氮化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to nitrogen compound)、白細(xì)胞與細(xì)胞黏附(Leukocyte cell-cell adhesion)、循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)程(Circulatory system process)等;CC主要富集到膜筏(Membrane raft)、膜面(Side of membrane)、細(xì)胞的頂端部分(Apical part of cell)、受體復(fù)合體(Receptor complex)、囊泡腔(Vesicle lumen)、溶泡(Lytic vacuole)、黑素體(Melanosome)等;MF主要富集到激酶結(jié)合(Kinase binding)、蛋白激酶活性(Protein kinase activity)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、趨化因子結(jié)合(Chemokine binding)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(Protein domain specific binding)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性(Protein tyrosine kinase activity)、脂質(zhì)結(jié)合(Lipid binding)等。

    圖10 GO分析結(jié)果

    2.7 關(guān)聯(lián)性分析

    將Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行連接,采用文本挖掘技術(shù)對(duì)疾病、復(fù)雜疾病和環(huán)境性疾病進(jìn)行了相關(guān)性分析?;蚪M中的所有基因均已用作富集背景,收集P<0.01,最小計(jì)數(shù)為3和富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與偶然預(yù)期的計(jì)數(shù)之間的比率)的術(shù)語(yǔ),并根據(jù)其成員相似度將其分組。

    結(jié)果如圖11所示,從圖中可看出上述篩出的瀉火消癭方的227個(gè)靶點(diǎn)與GD具有緊密的關(guān)聯(lián)性,GD排在首位,之后依次為腹主動(dòng)脈瘤(Aortic aneurysm,abdominal)、心肌缺血(Myocardial ischemia)、實(shí)驗(yàn)性糖尿病(Diabetes mellitus,experimental)、肺部疾病(Lung diseases)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy)等。此可證明篩出的227個(gè)靶點(diǎn)與其他疾病靶點(diǎn)具有重合靶點(diǎn),可推測(cè)GD與其他疾病具有并發(fā)關(guān)系。GD病癥常伴有心血管功能紊亂、呼吸功能異常、肝功能損害等表現(xiàn),特殊情況主要包括Graves眼病、甲亢性心臟病以及周期性麻痹等[2],以上現(xiàn)象均可證明GD與計(jì)算出的各個(gè)疾病具有緊密關(guān)聯(lián)。

    圖11 瀉火消癭方與疾病的關(guān)聯(lián)分析

    進(jìn)一步從發(fā)育、分化等方面探索227個(gè)靶點(diǎn)與各個(gè)細(xì)胞、組織的關(guān)聯(lián)性,從圖12中可發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方與HEPG2、HUVEC、DRG、心肌細(xì)胞等特異性細(xì)胞和肺、脾臟、骨髓、腎臟、肝臟等特異性組織,均具有緊密聯(lián)系。這與上文闡述的GD病變涉及五臟形成對(duì)應(yīng),證明了瀉火消癭方對(duì)GD的治療作用。

    圖12 瀉火消癭方與細(xì)胞、組織的關(guān)聯(lián)分析

    2.8 分子對(duì)接結(jié)果

    為驗(yàn)證本研究網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,以“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的Degree為依據(jù)進(jìn)行化學(xué)成分排序,選取前29位化學(xué)成分;將瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)與瀉火消癭方干預(yù)GD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖計(jì)算出的關(guān)鍵靶點(diǎn)相結(jié)合,對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行搜索,最終有14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的配體與受體可用,所以選取這14個(gè)靶點(diǎn)作為分子對(duì)接的關(guān)鍵靶點(diǎn),分別為SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2及MET;將化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)建立分子對(duì)接模型,將原配體從活性口袋中抽離并重新對(duì)接,計(jì)算對(duì)接后的RMSD及-CDOCKER ENERGY值。

    結(jié)果顯示,SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2、MET分子對(duì)接模型RMSD值分別為0.775 9、0.568 4、0.562 4、0.856 8、0.776 2、0.512 0、0.641 0、1.210 2、0.624 4、0.660 4、0.524 6、0.727 8、0.669 1、1.070 5 ?,均小于2 ?,認(rèn)為能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結(jié)合模式,對(duì)接結(jié)果具有較高可靠性,靶點(diǎn)具體信息見表1,靶點(diǎn)對(duì)接模型見圖13。

    表1 靶點(diǎn)信息

    圖13 靶點(diǎn)對(duì)接模型

    將上述14個(gè)靶點(diǎn)與29個(gè)潛在活性成分及3個(gè)治療GD的陽(yáng)性藥成分甲亢平(Y1)、丙硫氧嘧啶(Y2)、甲硫咪唑(Y3),進(jìn)行對(duì)接,對(duì)接結(jié)果如表2所示。各靶點(diǎn)與陽(yáng)性藥分子對(duì)接結(jié)果顯示,瀉火消癭方中部分潛在活性成分與靶點(diǎn)-CDOCKER ENERGY值大于Y1、Y2、Y3與靶點(diǎn)結(jié)合的-CDOCKER ENERGY值,表明瀉火消癭方的活性化學(xué)成分作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥。結(jié)合上述結(jié)果,瀉火消癭方中的成分與潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性,提示瀉火消癭方中藥材可能通過作用于潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)產(chǎn)生抗GD的作用。

    表2 對(duì)接結(jié)果

    3 討論

    3.1 瀉火消癭方治療GD潛在有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及可能作用機(jī)制

    通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)調(diào)研,基于已定化合物的OB和DL值,得出92個(gè)成分,重復(fù)成分有7個(gè)。篩選出瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)為227個(gè)。將以上收集的成分與靶點(diǎn)構(gòu)建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。本研究中,以Degree網(wǎng)絡(luò)特征為依據(jù)并進(jìn)行分析,得出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分排序表,進(jìn)而以Degree值中位數(shù)的2倍(Degree=30)為界限,篩選出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分29個(gè)和潛在靶點(diǎn)14個(gè)。

    本研究由網(wǎng)絡(luò)分析獲得的29個(gè)瀉火消癭方治療GD的潛在有效成分,包括植物甾醇、西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇葡萄糖苷、山柰酚、齊墩果酸、異葒草素、薯蕷皂苷和迷迭香酸等成分。文獻(xiàn)報(bào)道異葒草素可通過干擾癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控活性氧水平等多種途徑實(shí)現(xiàn)抗癌目的[19],熊果酸可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及影響腫瘤組織的血管生成[20],以上作用與KEGG富集得到的通路信息癌癥通路(Pathways in cancer)結(jié)果一致;在對(duì)紅景天苷的研究中得知其可通過調(diào)控Nrf2的表達(dá)逆轉(zhuǎn)由AGE引起的HK-2細(xì)胞凋亡以及糖尿病導(dǎo)致的腎臟組織損傷[21],這一作用與通路信息糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)息息相關(guān);在對(duì)齊墩果酸研究中發(fā)現(xiàn)其會(huì)使大鼠的血清甲狀腺素[Thyroxin(e)]水平降低和促甲狀腺素(TSH)水平升高[22],同時(shí)發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能顯著降低GD大鼠FT3、FT4水平[23],此外迷迭香酸可抑制細(xì)胞自噬[24],但都無(wú)法確定其具體機(jī)制?,F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)其他成分的報(bào)道較少,其抗GD的藥效及作用機(jī)制研究,同樣值得進(jìn)一步研究。

    本研究針對(duì)由網(wǎng)絡(luò)分析獲得的14個(gè)瀉火消癭方治療GD的作用靶點(diǎn)進(jìn)行討論,ESR1通過甲狀腺激素通路參與DNA相互作用轉(zhuǎn)錄表達(dá),該基因編碼雌激素受體[25];ESR2是屬于NR3亞家族核激素受體家族的核蛋白,是一種核激素受體,與雌激素的親和力類似于ESR1;IGF1R是激素胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的細(xì)胞表面受體;MAPK1是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中有重要作用[26];當(dāng)細(xì)胞在負(fù)面狀態(tài)下,MAPK通路被激活,進(jìn)而引起細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面的改變[27];MET基因編碼的蛋白為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR),與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控,是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素。以上靶點(diǎn)提示瀉火消癭方可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素分泌水平、激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)抗炎反應(yīng)、加強(qiáng)細(xì)胞分化和凋亡機(jī)制從而起到治療GD的效果。

    此外,對(duì)KEGG和GO得到的結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),瀉火消癭方或許能夠?qū)Χ喾N癌癥有所影響。其中KEGG條目有癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等;GO分析得到細(xì)胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to organic cyclic compound)、對(duì)氮化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to nitrogen compound)等條目,可推測(cè)瀉火消癭方或許能夠干預(yù)多種癌癥的進(jìn)程,但詳細(xì)的作用機(jī)制有待于后期研究。

    3.2 從分子層面分析瀉火消癭方的配伍機(jī)制

    GD病變涉及心、肝、脾三臟,肝郁化火,則見肝火亢旺。母病及子,致心火亢盛。肝木乘脾,脾失健運(yùn),釀生痰濕,痰氣交阻,血行不暢,氣、血、痰壅結(jié)頸前,痰氣郁結(jié)化火,終致心肝火旺。瀉火消癭方重用君藥龍膽清瀉肝膽實(shí)火,清利肝經(jīng)濕熱,臣以夏枯草、黃芩增強(qiáng)君藥清肝瀉火之力,切合前述GD肝火旺盛的病機(jī)。GD損傷肝陰的同時(shí),也會(huì)傷及心陰,出現(xiàn)心悸、煩躁、脈數(shù)等癥。故用生地黃、百合、知母滋陰養(yǎng)血,以使標(biāo)本兼顧,其中知母既善降火,又能滋陰。反佐穿山龍既防君臣寒涼太過,又防陰傷血澀之變。全方共奏清肝瀉火、滋陰寧心之功[12]。

    為了進(jìn)一步闡述瀉火消癭方的配伍機(jī)制,對(duì)前文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出的化學(xué)成分藥效Degree排序,并進(jìn)行分析(見圖4),發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分分布情況與復(fù)方藥材配伍有極大的相關(guān)性。龍膽中有12個(gè)化學(xué)成分排在前30位,說(shuō)明其在瀉火消癭方中發(fā)揮了君藥的重要作用。再以Degree的中位數(shù)(Degree=27)為限,對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行分析,君藥龍膽,臣藥夏枯草和黃芩的化學(xué)成分較多,龍膽有13個(gè)化學(xué)成分,夏枯草有13個(gè)化學(xué)成分,黃芩有22個(gè)化學(xué)成分,而生地黃、百合、知母、穿山龍分別有3、6、6、1個(gè)化學(xué)成分。推測(cè)龍膽為關(guān)鍵藥材,夏枯草與黃芩對(duì)龍膽具有協(xié)同效應(yīng),促進(jìn)和加強(qiáng)其對(duì)GD的治療,生地黃、百合、知母及穿山龍對(duì)治療GD起輔助補(bǔ)充之效。有文獻(xiàn)證明夏枯草多糖影響GD小鼠甲狀腺激素的合成和分泌[28];同時(shí),近期研究發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方中的重要成分黃芩苷可通過抑制mTOR信號(hào)通路重塑Tfh/Tfr細(xì)胞的平衡[29];文獻(xiàn)報(bào)道表明甲亢初期加用百合能夠降低Thyroxin(e)水平[30];知母主要成分知母皂苷能降低異常升高的β受體濃度,降低甲狀腺激素對(duì)CAMP的激活作用[31];且穿山龍主要成分薯蕷皂苷元可以緩解甲狀腺腫大癥狀[32]。以上文獻(xiàn)可證明復(fù)方中的藥材可在多方面緩解GD,從而改善GD病況。

    夏枯草化學(xué)成分中包含7個(gè)重復(fù)的化學(xué)成分,即存在較多重復(fù)的分子作用靶點(diǎn),或可說(shuō)明其作為臣藥輔助龍膽可加強(qiáng)對(duì)GD的治療作用。黃芩化學(xué)成分含量占比第一(36/104),分子作用靶點(diǎn)最多(160),其中有17個(gè)靶點(diǎn)為黃芩所獨(dú)有的,說(shuō)明此藥是對(duì)瀉火消癭方作用靶點(diǎn)的擴(kuò)充。百合和知母化學(xué)成分包含全方中Degree最大的植物甾醇(Degree=132),且無(wú)特有靶點(diǎn),或可說(shuō)明其在治療GD中,起到增強(qiáng)君藥與臣藥療效的功用。

    由成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖4)可知重復(fù)成分具有較大Degree的化學(xué)成分,包括植物甾醇(Degree=132)、西托糖苷(Degree=120)、β-谷甾醇(Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(Degree=80)、山柰酚(Degree=72)、齊墩果酸(Degree=68)和異葒草素(Degree=65),同時(shí)也是對(duì)接較好的成分(表2)。由此可得,單個(gè)成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn),或多個(gè)成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn),體現(xiàn)出中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。且復(fù)方中藥材成分相互重合,推測(cè)在合理配伍之后,利用其相互間的協(xié)同作用,可提高療效或減少不良反應(yīng),適應(yīng)復(fù)雜病情的治療。

    由前述研究可知,瀉火消癭方中7味中藥所含共同靶點(diǎn)為227個(gè),其中君藥龍膽占154個(gè),臣藥夏枯草和黃芩在共同靶點(diǎn)中分別占121、160個(gè),佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個(gè)。表明7味藥材具有大量的重疊靶點(diǎn),說(shuō)明復(fù)方藥材通過增強(qiáng)共同靶點(diǎn)的作用而改善GD病癥,揭示了復(fù)方用藥的原理。

    本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),通過計(jì)算機(jī)挖掘網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)方法對(duì)瀉火消癭方進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和通路分析,并對(duì)其活性成分的抗GD作用機(jī)制進(jìn)行探究。同時(shí)借助分子對(duì)接技術(shù)對(duì)瀉火消癭方的核心成分與治療GD潛在靶點(diǎn)的結(jié)合能力進(jìn)行研究,從而明確瀉火消癭方的主要調(diào)控靶點(diǎn),提示臨床用該方治療GD的合理性,為其后續(xù)療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選提供依據(jù)和方向。

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