利用LC-MS技術(shù)解析沙田柚、琯溪蜜柚種子代謝物的差異

崔學(xué)宇， 彭玉嬌， 陳眾峰， 李 靜， 邵元元， 侯彥林， 賈書剛

(1.南寧師范大學(xué)廣西地標(biāo)作物大數(shù)據(jù)工程技術(shù)研究中心/北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西地表過程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530001;2.上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司， 上海 201210)

沙田柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr. cv. Shatian Yu.)和琯溪蜜柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr. cv. Guanximiyou)是重要的柑橘栽培品種[1]，在我國南方廣泛種植。柚子種子是柚子食用、加工的副產(chǎn)物，研究表明，不同組別沙田柚種子數(shù)目在58.88～119.45之間[2];在我國柑橘加工后產(chǎn)生的種子達(dá)三萬t[3]；此外，不同柑橘種子的成分存在差異。因此對沙田柚和琯溪蜜柚種子成分進(jìn)行分析比較在柚類種子的加工利用中有著重要意義。

柑橘種子油脂含量較高[4-6]。對廣東省梅州市、廣西區(qū)容縣的沙田柚研究表明，柚籽富含亞油酸，可以作為較好的食用調(diào)和油原料[7-8]。柑橘種子還有重要的藥用價(jià)值，蜜柚種子的提取物可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[9]，在蜜柚、沙田柚種子中提取的檸檬苦素具有消炎止痛的功效[10-12]。此外，柚子種子還富含其他生物活性物質(zhì)[13]，在食品保鮮、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域發(fā)揮重要的功效[14-15]。

柚類種子在油料、中藥中均有一定的應(yīng)用，但是其具體成分以及重要柚類品種沙田柚和琯溪蜜柚種子的成分及其差異均不清晰。

本研究利用液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)對沙田柚和琯溪蜜柚的種子進(jìn)行分析，以期明確其種子主要成分和成分差異，為柚類種子生物學(xué)和柚類種子加工利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本處理

2019年9月中旬，在沙田柚、蜜柚核心產(chǎn)區(qū)廣西區(qū)容縣自良鎮(zhèn)“沙田柚王國”取制種用蜜柚種子，2019年11月初，取制種用沙田柚種子，將其分別均勻混合后備用，容縣是沙田柚的原產(chǎn)地，琯溪蜜柚為福建引種。

1.2 試驗(yàn)方法

種子百粒重為百粒種子直接稱重，3次重復(fù)；種子粒長、粒寬為數(shù)10粒種子，利用游標(biāo)卡尺測量，3次重復(fù)。

LC-MS非靶向代謝組測序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。具體操作如下：

1) 10粒種子液氮研磨后取80 mg，加入內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1；Lyso PC 17∶0，0.01 mg·mL-1，均為甲醇配置)各20 μL和1 mL的甲醇溶液(V甲醇∶V水=7∶3)及小鋼珠，然后放入研磨機(jī)。

2) 超聲提取30 min。

3) 在-20 ℃條件下靜置20 min。

4) 4 ℃條件下13 000 r·min-1離心10 min，取300 μL上清液揮干，然后用400 μL 甲醇溶液(V甲醇∶V水=1∶4)復(fù)溶，渦旋30 s，超聲2 min，4 ℃條件下13 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾，利用ACQUITY UPLC超高效液相串聯(lián)AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測試。

質(zhì)控樣本(QC)：所有樣本各取等量混合作為QC樣本。質(zhì)譜上機(jī)過程中，每4個(gè)正式樣本中插入一個(gè)QC樣本，QC樣本用于評價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)質(zhì)譜平臺的穩(wěn)定性。

種子形態(tài)數(shù)據(jù)利用SPSS 23進(jìn)行計(jì)算；UNIFI 1.8.1.軟件用于非靶向代謝組原始數(shù)據(jù)的采集；使用 The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v 2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫對結(jié)果進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙田柚、琯溪蜜柚種子的百粒重、粒長、粒寬性狀

沙田柚種子百粒重為(19.76±0.44)g，琯溪蜜柚為(16.18±0.56)g，百粒重性狀二者之間差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)；沙田柚種子粒長為(17.96±0.57)mm，琯溪蜜柚為(15.46±0.21)mm，二者之間差異達(dá)顯著水平(p<0.05)；沙田柚種子粒寬為(8.27±0.58)mm，琯溪蜜柚為(7.51±0.17)mm，二者之間差異未達(dá)顯著水平。

2.2 沙田柚、琯溪蜜柚種子代謝產(chǎn)物

本研究中合計(jì)檢測出物質(zhì)峰為12 415個(gè)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對出的代謝物數(shù)量為6 498，其中負(fù)離子為2 603，正離子為3 895。在Super Class層級對其分類發(fā)現(xiàn)，其中包括3 651種脂類及類脂分子，沙田柚特有88種，琯溪蜜柚特有134種；360種苯丙酸類和聚酮化合物，沙田柚特有5種，蜜柚特有12種；299種有機(jī)酸及其衍生物，沙田柚特有3種，琯溪蜜柚特有7種；297種雜環(huán)類化合物，沙田柚特有6種，琯溪蜜柚特有17種；259種有機(jī)氧化合物，沙田柚特有6種，琯溪蜜柚特有7種；71種苯環(huán)類物質(zhì)，沙田柚特有5種，琯溪蜜柚特有7種；45種核苷及核苷酸類似物，沙田柚特有1種；44種有機(jī)氮化合物；37種生物堿及其衍生物，其中沙田柚特有2種，琯溪蜜柚特有1種；19種木質(zhì)素類化合物；2種有機(jī)硫化合物；其余為未定義組別，沙田柚特有31種，琯溪蜜柚特有59種。

2.3 沙田柚、琯溪蜜柚種子的主成分分析(PCA)及聚類分析

沙田柚種子、琯溪蜜柚種子和QC樣本的PCA分析如圖1所示，61.1%的變量可以被解釋，經(jīng)7次循環(huán)交叉驗(yàn)證得到的PCA模型圖，QC樣本緊密聚集在一起，表明此實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，沙田柚種子和琯溪蜜柚種子可以被明顯區(qū)分開。

表1 差異黃酮類代謝物(琯溪蜜柚、沙田柚)

對代謝物進(jìn)行聚類，橫縱聚類結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，沙田柚和琯溪蜜柚的種子代謝物相對豐度存在顯著差異，沙田柚和琯溪蜜柚的種子被劃分在兩個(gè)類群當(dāng)中。

2.4 沙田柚、琯溪蜜柚種子差異代謝物的篩選

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，來篩選組間差異代謝產(chǎn)物。利用變量權(quán)重值(Variable important in projection,VIP)衡量各代謝物對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，利用t檢驗(yàn)驗(yàn)證組間差異代謝物的顯著性(VIP>1，p<0.05)。經(jīng)過分析后，合計(jì)得到差異代謝物853個(gè)，根據(jù)log 2(FC)值正負(fù)判斷組內(nèi)平均表達(dá)量，琯溪蜜柚種子中有479個(gè)代謝物表達(dá)上調(diào)，374個(gè)表達(dá)下調(diào)，篩選后的差異代謝物火山圖如圖3所示。

根據(jù)VIP值對差異代謝物表達(dá)量前50的代謝產(chǎn)物進(jìn)行整理，將其表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，表達(dá)量進(jìn)行層次聚類，代謝物及其聚類結(jié)果如圖4所示。在Super Class層級對其分類發(fā)現(xiàn)，其中包括1個(gè)有機(jī)氧化合物、1個(gè)有機(jī)氮化合物、3個(gè)有機(jī)酸及其衍生物、4個(gè)聚酮類化合物、4個(gè)雜環(huán)類化合物、6個(gè)未分類化合物、31個(gè)脂類及類脂分子，因此利用沙田柚和琯溪蜜柚種子做食用調(diào)和油時(shí)，其成分可能存在差異。

2.5 差異代謝產(chǎn)物的代謝途徑分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對沙田柚及琯溪蜜柚種子差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析。顯著差異的代謝通路結(jié)果如圖5所示(條柱高于藍(lán)線表示為p<0.05，高于紅線表示p<0.01)。由圖5可知，累計(jì)20個(gè)代謝通路p<0.05，這20個(gè)代謝通路是：2-氧代羧酸代謝通路、苯丙素生物合成、檸檬酸循環(huán)、黃酮類生物合成、碳代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成、硫苷生物合成、二羧基乙醛酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、氰胺酸代謝、色氨酸代謝、賴氨酸降解、丙酮酸代謝、C 5支鏈二元酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、谷胱甘肽代謝、托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成、丁酸代謝，被顯著富集的代謝通路主要涉及物質(zhì)的合成和分解。

2.6 沙田柚、琯溪蜜柚種子中的黃酮類化合物及其在代謝中的差異

黃酮類化合物是柑橘中重要的工業(yè)用、藥用物質(zhì)。本研究中獲得1 134個(gè)黃酮類化合物，有234個(gè)黃酮類化合物存在差異，其中20種為沙田柚特有，27種為琯溪蜜柚特有。根據(jù)VIP值判斷，差異表達(dá)量前50的代謝產(chǎn)物中，有14個(gè)黃酮類代謝物，是在Sub Class分級中最多的物質(zhì)(表1)。

黃酮類生物合成途徑同樣被顯著富集，其中涉及7個(gè)代謝物質(zhì)的差異，這7個(gè)物質(zhì)中，琯溪蜜柚種子中上調(diào)的是圣草酚(Eriodictyol)、普魯寧(柚皮素單糖苷，Prunin)、表兒茶素(Epicatechin)、柚皮苷(Naringin)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯((+)-Gallocatechin)，下調(diào)的是柚皮素((-)-Naringenin)和綠原酸(Chlorogenic acid)。

3 討 論

柑橘屬植物在我國主要作鮮食用，另有部分可作為加工，在此過程中產(chǎn)生大量的柑橘種子多作為廢渣直接排放[3]，同時(shí)在柑橘加工過程中會產(chǎn)生大量的種子，因此開發(fā)利用柑橘種子是提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要手段[16]。孫謙等[17-18]對柑橘水果類種子的脂肪酸組成和提取方式進(jìn)行了一定的研究，這些研究均證明了柑橘類水果種子中含有豐富的油脂，是榨油的良好材料。本研究也證實(shí)了這點(diǎn)，利用LC-MS的方法在2種柚類種子中鑒定到的6 498種代謝物中包括了3 651種脂類及類脂分子，鑒定得到物質(zhì)數(shù)遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的提取方法，這一結(jié)果可以更好的服務(wù)柚子種子的加工利用。

柑橘黃酮在醫(yī)藥、食品添加劑、工業(yè)色素和化妝品行業(yè)均有應(yīng)用[19-20]。不同的柑橘黃酮有不同的應(yīng)用，如橙皮苷(hesperidin,Hsd)及其糖苷配基橙皮素(hesperetin,Hst)可以在生物體內(nèi)起抗炎的作用[21]。本研究共獲得1 134個(gè)黃酮類化合物，其中234個(gè)黃酮類化合物在琯溪蜜柚和沙田柚種子中存在差異，在差異表達(dá)量前50的代謝產(chǎn)物中，有14個(gè)黃酮類代謝物，同時(shí)黃酮類生物合成途徑有7個(gè)差異代謝物質(zhì)被富集，這一結(jié)果有助于沙田柚種子和琯溪蜜柚種子的差異利用，可為在分子水平解釋黃酮類物質(zhì)的生物合成提供一定的證據(jù)。

4 結(jié) 論

沙田柚種子百粒重顯著大于琯溪蜜柚，粒長顯著長于琯溪蜜柚，粒寬二者無顯著差異。利用LC-MS手段檢測出6 498個(gè)代謝物數(shù)量。在Super Class層級對其分類發(fā)現(xiàn)，脂類是其主要的物質(zhì)，在2種種子中共檢測出3 651種脂類及類脂分子，其中沙田柚特有88種，琯溪蜜柚特有134種；主成分分析(PCA)以及聚類分析發(fā)現(xiàn)，沙田柚種子和蜜柚種子可以被顯著區(qū)分開；對差異代謝物的分析發(fā)現(xiàn)，二者共有853個(gè)差異代謝物，其中表達(dá)量前50的差異代謝物主要是脂類及類脂分子；對黃酮類物質(zhì)進(jìn)行具體分析發(fā)現(xiàn)，1 134個(gè)黃酮類化合物中有234個(gè)存在差異，黃酮類生物合成途徑中有7個(gè)代謝物質(zhì)存在差異，這7個(gè)物質(zhì)可能是沙田柚種子和蜜柚種子黃酮類物質(zhì)差異的原因。本研究為沙田柚、蜜柚種子的區(qū)別利用提供一定依據(jù)。